AKT抑制劑E20誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡和自噬

張杰，楊煜鋒，胡婷婷，吳聰，楊子飛，吳賢敏

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.耳鼻咽喉-頭頸外科；2.消化內(nèi)科

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種高侵襲性、轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，主要發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮。西方國家和拉丁美洲的NPC發(fā)病率低于1/10萬[1]。在東南亞、地中海盆地和中東地區(qū)，NPC發(fā)病率較高[2]。據(jù)報道，華南地區(qū)每年每10萬人中有15～50名NPC患者[3]。在NPC的發(fā)展過程中，包括EB病毒感染、環(huán)境和遺傳因素在內(nèi)的許多因素可能起重要作用[2]。對于早期NPC，放療是一種有效的治療方法，而晚期NPC因顱底及頸部淋巴結(jié)的侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[4]。

眾所周知，PI3K/AKT信號通路在腫瘤中控制著重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，包括維持蛋白合成、細(xì)胞生存、生長、轉(zhuǎn)移、凋亡、自噬、代謝、血管生成和細(xì)胞周期調(diào)控[5]。AKT抑制劑單獨使用或與其他化療藥物聯(lián)合使用均可有效抑制腫瘤生長[5-7]。 GSK2141795（也稱GSK-795）是英國葛蘭素史克公司開發(fā)的一種新型AKT抑制劑，目前正處于早期臨床試驗階段，以評估其對多種類型癌癥的治療效果，如多發(fā)性骨髓瘤（NCT01989598）和乳腺癌（NCT01964924）。浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計研究所以GSK-795為原型通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計優(yōu)化生成其3，4，6-三取代哌啶衍生物，簡稱E20，與GSK-795相比，E20對LNCaP、OVCAR-8和HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更強的AKT抑制和抗增殖活性[8]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，我們將E20應(yīng)用于CNE-2細(xì)胞，研究其是否能抑制CNE-2細(xì)胞的增殖，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 E20由浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計研究所提供；人NPC細(xì)胞系CNE-2購自中科院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素G購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自北京Protein Biotechnology公司；Mito-SOX試劑盒購自美國Life Technologies公司；AnnexinVFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自美國Bio-Rad公司；ECL顯色液購自美國Abcam公司；一抗、二抗均購自美國Sigma公司；戊二醛、鋨酸及乙酸鈾酰均購自美國Sigma-Aldrich公司；丙酮購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)氧樹脂購自英國TAAB公司；枸櫞酸鉛購自美國Polysciences公司。

1.2 方法

1.2 .1 細(xì)胞培養(yǎng)：將CNE-2細(xì)胞系維持在DMEM培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清以及100 kU/L的青霉素G），置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。

1.2 .2 給藥處理：E20溶解于DMSO中，原液濃度為1 mg/mL。DMEM稀釋E20處理CNE-2細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液在處理過程中更換為含E20的DMEM。制備CNE-2細(xì)胞懸液，接種于96孔板或6孔板中，放置在37 ℃， 含5% CO2的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)。用不同濃度（0、1、 5 μg/mL）的E20處理細(xì)胞12、24、48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 .3 CCK8法檢測細(xì)胞增殖：首先，細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，密度為2 000個細(xì)胞/孔。培養(yǎng)24 h后，分別用不同濃度（0、1、5 μg/mL）的E20處理不同時間（12、24、48 h），用CCK8細(xì)胞計數(shù)試劑盒在不同時間點計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.2 .4 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡及活性氧 （reactive oxygen species, ROS）的生成：Mito-SOX用來分析ROS的生成。用E20（0、1、5 μg/mL）轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞24 h，胰酶處理后，1 000 r/min離心5 min，加入Mito-SOX溶液10 min，PBS洗滌2次。最后，通過流式細(xì)胞法分析ROS的產(chǎn)生。使用 Annexin V（ANXA5）試劑盒分析細(xì)胞凋亡水平。CNE-2細(xì)胞經(jīng)E20（0、1和5 μg/mL）作用24 h，胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2次后，在濃度為1×106cells/mL的結(jié)合緩沖液中重懸，與ANXA5-FITC和碘化丙啶輕度混合。然后，細(xì)胞在 37 ℃，5% CO2的空氣中無光孵育30 min。最后用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析。每個實驗至少重復(fù)3次。

1.2 .5 Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)：將CNE-2細(xì)胞系懸浮于冰上的RIPA裂解緩沖液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。樣品用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用含5%脫脂奶粉和0.1% Tween 20的TBS封閉緩沖液在室溫下封閉膜1 h，然后在TBST中與一抗在 4 ℃孵育過夜。然后，在TBST中洗滌3次，然后與HRP結(jié)合的二抗（1:5 000）孵育1 h，再用TBST洗滌3次。用ECL顯色。每個實驗至少重復(fù)3次。

1.2 .6 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的改變：CNE-2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，立即在2.5%戊二醛中固定24 h，然后在1%鋨酸中固定1～2 h。此后，用丙酮脫水，包埋在環(huán)氧樹脂中。超薄切片用堿性檸檬酸鉛和酒精性乙酸鈾酰染色，用蒸餾水輕輕洗滌，最后用JEM 1230透射電子顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 使用Microsoft Excel和GraphPad Prism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，再采用Dunnett多重比較檢驗分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E20抑制CNE-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞凋亡 為了確定E20處理CNE-2細(xì)胞的適宜濃度和時間，采用不同濃度的E20在不同的時間點處理CNE-2細(xì)胞。CCK8檢測結(jié)果顯示，E20處理12 h后，5 μg/mL E20組存活細(xì)胞數(shù)較對照組減少（P＜0.05），而1 μg/mL E20組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A。E20作用24 h后，與對照組相比，1 μg/mL E20組（P＜0.05）和5 μg/mL E20組（P＜ 0.01）細(xì)胞數(shù)量顯著減少，見圖1B。E20處理48 h后，與對照組相比，1 μg/mL E20組（P＜0.01）和5 μg/mL E20組（P＜0.01）存活細(xì)胞數(shù)量減少更顯著（見圖1C）。說明E20可抑制CNE-2細(xì)胞的存活和增殖。隨著E20濃度和處理時間的增加，CNE-2細(xì)胞的存活率和增殖率呈下降趨勢。E20處理48 h后，5 μg/mL E20組細(xì)胞幾乎全部凋亡。因此，本研究選擇E20處理24 h作為合適的處理時間。

采用PI標(biāo)記死亡細(xì)胞，Annexin V標(biāo)記凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E20處理24 h后，與對照組相比，隨著E20濃度的增加，死亡和凋亡的CNE-2細(xì)胞的比例均顯著增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，E20處理濃度為 1 μg/mL或更高時，與未處理對照相比，死亡和凋亡細(xì)胞比例均顯著增加。結(jié)果進(jìn)一步表明，與對照組相比，1 μg/mL E20組（P＜0.05）和5 μg/mL E20組（P＜0.01）CNE-2細(xì)胞凋亡明顯增加（見圖1D和圖1E）。

圖1 E20對CNE-2細(xì)胞存活的影響

2.2 E20增加線粒體ROS水平，引起線粒體形態(tài)改變 為了評估E20處理后CNE-2細(xì)胞的線粒體ROS水平，采用Mito-SOX，一種選擇性標(biāo)記線粒體超氧化物的氧化還原熒光團(tuán)。結(jié)果表明，與對照組相比， 5 μg/mL E20組Mito-SOX水平極顯著升高（P＜0.01）。同時，1 μg/mL E20組與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A、圖2B。為驗證E20誘導(dǎo)的ROS生成是否會導(dǎo)致線粒體損傷，采用透射電鏡觀察E20處理24 h后CNE-2細(xì)胞的線粒體形態(tài)。透射電鏡結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μg/mL和5 μg/mL E20組CNE-2細(xì)胞線粒體形態(tài)異常，核膜腫脹變性并伴有局部內(nèi)陷。而且，隨著E20濃度的增加，核膜內(nèi)陷越來越嚴(yán)重（見圖2C）。

圖2 E20對CNE-2線粒體的影響

2.3 E20下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)AIF表達(dá) 為了進(jìn)一步驗證E20的促凋亡作用，通過Western blot分析抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子AIF的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，5 μg/mL E20組Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），1 μg/mL組與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3A。與對照組比， 1 μg/mL和5 μg/mL E20組AIF表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3B。

圖3 不同濃度E20處理CNE-2后凋亡相關(guān)蛋白的變化

2.4 E20誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞自噬 為了檢測E20處理后CNE-2細(xì)胞自噬的變化，使用TEM觀察自噬小體的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，1 μg/mL和5 μg/mL E20組CNE-2細(xì)胞胞漿中存在多個自噬小體（見圖4A）。此外， 1 μg/mL和5 μg/mL E20處理后，細(xì)胞自噬小體數(shù)量顯著增加（P＜0.01），見圖4B。

圖4 不同濃度E20處理CNE-2電鏡下自噬小體生成變化

2.5 E20上調(diào)LC3B-II表達(dá)，下調(diào)P62表達(dá) 為進(jìn)一步驗證E20處理后細(xì)胞自噬的變化，Western blot檢測LC3B-I、LC3B-II和P62的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μg/mL E20組和5 μg/mL E20組LC3B-II表達(dá)增加（P＜0.05），且隨著濃度增加而增加，見圖5A。與對照組相比，5 μg/mL E20組P62表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。1 μg/mL組與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5B。

圖5 不同濃度E20處理CNE-2后自噬相關(guān)蛋白的變化

3 討論

細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的異常激活是腫瘤發(fā)生的主要原因之一，因此該信號通路已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的關(guān)鍵靶點[9]。AKT激酶作為PI3K的下游靶點，位于該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心。目前已有多種AKT抑制劑用于治療卵巢癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤的臨床試驗，其中大部分為II-III 期[10]。DONG等[8]研究表明E20是一種基于GSK-795的新型AKT變構(gòu)抑制劑，其抑制AKT1和腫瘤細(xì)胞方面效果優(yōu)于GSK-795。然而，尚未對NPC細(xì)胞系進(jìn)行研 究。ZHAO等[11]發(fā)現(xiàn)一種AKT變構(gòu)抑制劑（MK-2206）在體內(nèi)和體外對CNE-1和CNE-2細(xì)胞具有較強的抗增殖作用，通過調(diào)節(jié)自噬而不是直接引起細(xì)胞凋亡。盡管一項針對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性NPC患者的MK-2206的多中心II期研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206治療耐受性良好，而且一些患者在較長時間內(nèi)實現(xiàn)了疾病穩(wěn)定，但由于在這個重度預(yù)處理的患者組觀察到的活動有限，該試驗被終止[12]。因此，NPC患者仍然缺乏一種特別有效的AKT抑制劑。在本研究中，使用E20作為治療CNE-2細(xì)胞的藥物，發(fā)現(xiàn)E20處理后不僅能誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞凋亡，而且能促其發(fā)生自噬。

細(xì)胞凋亡被稱為I型程序性細(xì)胞死亡，其作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)越來越清晰。許多研究報道ROS與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。增加ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。線粒體途徑作為細(xì)胞凋亡最重要的途徑，被稱為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，其主要作用受到Bcl-2家族蛋白的嚴(yán)格調(diào)控[15]，分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩 類[15-16]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其抗凋亡作用可能與Bcl-2抑制凋亡過程中ROS產(chǎn)生有關(guān)，Bcl-2能有效清除超氧陰離子等氧自由基，抑制過氧化物的產(chǎn)生和ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[17-18]。AIF是一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子。正常情況下，AIF是一種位于線粒體膜上的黃素蛋白。AIF在凋亡信號刺激下從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，通過核定位信號轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，直接導(dǎo)致染色體凝集，DNA碎裂成大片段（～50 kb），進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)E20處理后，細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，AIF表達(dá)上調(diào)，線粒體形態(tài)發(fā)生改變。這些結(jié)果表明，E20可通過誘導(dǎo)線粒體依賴的凋亡通路促進(jìn)CNE-2細(xì)胞凋亡。此外，線粒體中ROS生成增加也可能提示E20的抗腫瘤機制可能是通過調(diào)節(jié)ROS水平。

自噬也被稱為II型程序性細(xì)胞死亡，近年來已被證明在細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。有報道稱，透射電鏡觀察自噬小體是自噬的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一，而LC3B-I向LC3B-II的轉(zhuǎn)化也是自噬的可靠標(biāo)志[20]。YOSHII等[21]假設(shè)LC3B-II與LC3B-I的比例與自噬體的數(shù)量成正比。P62包含一個泛素結(jié)合域和一個與LC3相互作用的基序。通過將泛素化底物與自噬機制連接，P62可以與自結(jié)合蛋白結(jié)合到自噬溶酶體中，最終被降解[22]。在本研究中，E20處理后LC3BII表達(dá)上調(diào)，P62表達(dá)下調(diào)，提示E20可能誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞自噬。自噬小體的TME觀察進(jìn)一步證實了這一結(jié)果。

綜上所述，本研究證明了E20作為一種新型AKT抑制劑，通過誘導(dǎo)凋亡并同時可能通過自噬發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)E20通過啟動ROS依賴的線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，根據(jù)目前的研究報道，凋亡和自噬不僅是相關(guān)的，而且相互調(diào) 節(jié)[23]，所以在本研究中，凋亡與自噬是否存在相關(guān)性以及二者之間的具體調(diào)控機制仍有待進(jìn)一步探討。總之，本研究提示E20對NPC細(xì)胞具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，可作為一種新的AKT抑制劑為NPC的治療提供新的選擇。