antagomir-30d轉染BMSCs聯合CPC支架材料的異位成骨作用

陳威，汪艷，金瓊，黃慧

1.溫州醫科大學附屬口腔醫院 兒童口腔科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬口腔醫院 種植科，浙江 溫州 325000；3.上海交通大學附屬第九人民醫院 修復科，上海 200011

本課題組前期體外實驗結果證實了antagomir-30d正性調控大鼠骨髓基質干細胞的成骨分化作用[1]，針對這一研究成果，本研究擬建立體內實驗動物模型，進一步驗證miR-30d對成骨調控的作用。研究假設由骨生長調控因子miRNA、種子細胞骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）、生物支架材料磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）構建的組織工程骨復合物可以用作理想的骨再生材料。實驗中，我們將復合物植入到裸鼠皮下，并分別于植入后2周、4周、8周取出植入體。其中，2周的植入體用于抽提RNA進行RT-PCR檢測，分析成骨基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、骨鈣素（osteocalcin, OC）和Runt相關轉錄因子2（Runtrelated transcription factor 2, RUNX2）mRNA水平的表達情況。植入后4周、8周的植入體取出進行苦味酸品紅組織學染色和組織形態學計量觀察分析新骨生成情況。實驗通過構建骨重建調控因子antagomir-30d/種子細胞BMSCs/CPC支架材料組織工程骨復合物用于BALB/c裸鼠皮下異位成骨模型，探討其與新生骨形成之間可能的聯系，為深入研究miRNAs的功能及體內應用提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料 8周齡SPF級BALB/c裸鼠15只，雄性，健康。所有動物及培養條件均由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（滬）2020-0025。多孔支架材料CPC，由上海瑞邦生物材料有限公司提供，孔徑400～500 μm，孔隙率約為72%。成品為圓柱形外觀，直徑5 mm，高2 mm，經高溫高壓消毒備用。α-MEM培養基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit購自日本Takara公司，Superscript II反轉錄試劑盒購自日本Takara公司，RNAse Free Water購自美國Ambion公司，品紅購自上海邁坤化工有限公司，苦味酸購自上海順勃生物工程有限公司。

1.2 大鼠BMSCs的獲取和培養方法 大鼠脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，在無菌條件下取其脛骨和股骨，剔除其周圍附著肌肉，將其兩端干骺端剪除，暴露骨髓腔。10 mL無菌注射器吸取含有肝素（200 U/mL）和10% FBS的α-MEM培養液反復沖洗骨髓腔至由紅色變為白色。細胞懸液以 1 800 r/min的轉速離心10 min，棄上清液，加入標準培養液10 mL，用滴管輕輕吹散細胞團后接種于10 cm培養皿上。放置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養箱中培養。次日首次換液，以后每3 d換液。待鏡下觀察細胞呈80%匯合時，吸棄培養液，0.25%胰酶和0.02% EDTA消化貼壁細胞，在1～2 min于鏡下見貼壁細胞皺縮后，加入適量培養液終止消化，吸取培養液輕吹尚未脫落的細胞至所有細胞懸起，然后轉移至離心管內，吹打使之分散均勻。用血細胞計數板計數細胞數量。將細胞懸液以1 000 r/min 的轉速離心5 min，棄上清液，加入α-MEM培養液，調整細胞濃度為1×105/mL，輕輕吹打使細胞分散均勻，接種于數個10 cm培養皿內，置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件培養箱中培養，每3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態變化。待細胞80%匯合時按上述操作進行傳代。采用第2或第3代細胞進行后續實驗。細胞行成骨誘導分化時，需采用成骨誘導培養液。

1.3 細胞處理 采用第2或第3代BMSCs鋪板于6孔板底，每孔的細胞密度為1×105個/孔。實驗共分3組：空白對照組、antagomir-30d組、NC組（NC為采用無意義的一段核苷酸，用于antagomir-30d的陰性對照）。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC使之終濃度為150 nmol/L，空白對照組不做處理。48 h后更換成骨誘導液，每3 d換液，培養至7 d，收集細胞。

1.4 裸鼠異位成骨分析

1.4 .1 實驗分組：本研究分為3組：CPC+未做轉染的BMSCs（空白對照組）；CPC+轉染150 nmol/L antagomir-30d的BMSCs（antagomir-30d組）；CPC+轉染150 nmol/L NC的BMSCs（NC組）。

1.4 .2 細胞支架材料復合物的體外構建：①將直徑為5 mm，高2 mm的圓柱形多孔CPC材料放入EP管中，消毒備用。②處理細胞，成骨誘導7 d后，0.25% 胰酶和0.02% EDTA消化收集細胞，制備成細胞懸液，使其終濃度為1×107個/mL，然后將各組細胞（未做轉染的BMSCs、轉染150 nmol/L antagomir-30d的BMSCs、轉染150 nmol/L NC的BMSCs）分別接種于消毒備用的圓柱狀CPC支架材料上，使材料飽和而沒有含細胞的培養液流出。③將各組細胞因子支架材料復合體植入裸鼠皮下（方法見1.4.3）。④剩余細胞材料復合體于體外繼續培養。待體外培養至1、3 d后，收集細胞材料復合體于掃描電鏡下觀察超微形態。將細胞材料復合體于預冷的2.5%戊二醛固定液中固定。固定完成后，不同濃度乙醇中梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%、100%）。各乙醇濃度分別脫水10 min。抽真空，噴金，掃描電鏡觀察細胞黏附與伸展。

1.4 .3 手術方法：①SPF級BALB/c裸鼠行乙醚吸入麻醉。取其正中俯臥位，將其背部脊柱兩側術區用75%乙醇消毒。②在裸鼠背部正中兩側，距脊柱約10 mm處，沿脊柱長軸切開，作長約15 mm的長條形切口，鈍性分離至切口下約10 mm。共作3個切口[2]。③隨機將antagomir-30d組、空白對照組和NC組細胞因子支架材料復合體植入裸鼠背部各切口處。4-0縫線縫合，放回籠內飼養。

1.4 .4 術后動物大體觀察：觀察術后動物的精神、飲食情況、傷口有無感染以及有無材料排出等異 常[2]。

1.4 .5 植入物大體觀察：分別于術后第2、第4、第8周，處死裸鼠5只。取出植入物，并觀察其形態、色澤及包膜情況。

1.5 RT-PCR TRIzol法抽提細胞總RNA。依照反轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA。根據NCBI網站 GenBank數據庫查詢大鼠相關基因的mRNA序列，應用Oligo 6.71軟件進行引物設計[3]。

1.6 組織學染色

1.6 .1 硬組織切片的制備：分別于術后4周、8周取出植入物，經過固定，脫水，透明，滲透，包埋后切片處理。

1.6 .2 硬組織切片苦味酸品紅組織學染色：標本超聲去雜質30 s，雙蒸水沖洗2 min；將切片置于0.1%甲酸溶液中3 min，流水沖洗2 min；置于20%甲醇中2 h，流水沖洗2 min；將切片置于60 ℃恒溫水浴箱內，Stevenol藍染液染色5 min；60 ℃雙蒸水沖洗2 min，并擦干；室溫下，用現配的苦味酸品紅溶液染色，染色8 min；100%乙醇洗滌2次，切片盒中操作。顯微鏡下觀察和拍照。

1.6 .3 組織形態學分析：將第4周及第8周的組織學切片，置于低倍顯微鏡下電腦攝取圖像（Image Pro 6.0 system），包括完整的植入物視野。利用圖像分析軟件統計新生骨在各植入物區域所占的面積百分比。

1.7 統計學處理方法 應用SPSS18.0統計軟件處理。正態分布計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs在CPC表面生長的超微形態觀察 掃描電鏡下觀察可見BMSCs在CPC支架上生長良好，復合培養l d后，BMSCs細胞黏附于CPC表面，有的細胞突觸開始伸展；3 d后，可見細胞數量明顯增多，在CPC表面連接成片，相互融合。見圖1。

圖1 掃描電鏡觀察BMSCs在CPC材料上生長情況（×500）

2.2 實驗動物大體觀察 植入手術后所有實驗裸鼠蘇醒順利，且精神、活動、飲食正常。傷口愈合良好，未觀察到有紅腫、感染、開裂及竇道形成，未觀察到植入物排出[2]。整個實驗期內，未出現實驗動物死亡（見圖2）。

圖2 實驗動物大體觀察

2.3 植入物大體觀察 植入后至取出的各時間點，植入物周圍有薄層纖維膜樣物質覆蓋，外觀保持圓柱形，植入體周圍無積液，無化膿感染現象（見圖3）。

圖3 植入物大體觀察

2.4 植入4周后組織學觀察 復合物植入后4周，光學顯微鏡下觀察顯示，空白對照組和NC組均未見新骨形成，而antagomir-30d組則有少量新骨形成，新生骨緊貼CPC支架材料，主要分布在支架材料的四周，呈花邊狀。見圖4。

圖4 植入4周組織形態圖

2.5 植入8周后組織學觀察 植入8周后，光學顯微鏡下觀察顯示（見圖5），空白對照組和NC組均有明顯新骨形成，而antagomir-30d組新骨形成大大增加，新生骨滲透整個CPC支架材料。

圖5 植入8周組織形態圖

2.6 組織形態學分析 支架材料復合物植入4周后，空白對照組和NC組均未見新骨形成，而antagomir-30d組新骨面積百分比為1.28%±0.19%。支架材料復合物植入8周后，空白對照組新骨面積百分比為2.33%±0.52%，NC組新骨面積百分比為1.82%±0.53%，而antagomir-30d組新骨面積百分比明顯高于空白對照組與NC組（P＜0.05），達到17.79%±1.15%。

2.7 植入2周后RT-PCR結果 體內植入2周后，取出各組植入物，抽提總RNA進行RT-PCR實驗，結果表明，各成骨基因ALP、OC、RUNX2的mRNA水平表達量antagomir-30d組最高，明顯高于NC組及空白對照組（P＜0.05），見圖6。

圖6 植入2周后RT-PCR檢測各成骨基因的表達量

3 討論

目前，骨移植材料根據來源大致可分為四類：自體骨、異體骨、異種骨和人工骨。其中，自體骨移植會增加患者創傷，而且取骨量有限，移植手術所引起的不良反應如疼痛、感染、出血等限制了它的應用[4]；異體骨和異種骨均存在排異反應，其中異種骨排異反應更為劇烈，而異體骨還存在交叉感染問題。利用骨組織工程構建形成的人工骨，可以按需塑形、批量生產，提供了修復大面積骨缺損的可能，目前已經成為理想的創傷修復和功能重建的材料[5]。

近年來，利用骨組織工程技術治療種植體骨量不足、骨結合不良、骨缺損等已顯示出卓越的治療前景。具有再生能力的種子細胞、骨生長因子，以及人工合成的生物支架材料是骨組織工程的三大組成要素[6]。這三大要素可相互組合從而構建組織工程骨：種子細胞/支架材料/生長因子；種子細胞/支架材料；生長因子/支架材料。

本研究所選用的CPC是一種新型人工骨支架材料，由于材料本身具備良好的生物活性與生物相容性，自1986年開始就受到了較多的關注[7-9]。細胞的黏附、增殖等過程與材料的物理結構以及化學成分相關[10-11]。本研究中將細胞材料復合體于體外培養分別至1、3 d后，掃描電鏡觀察超微形態，結果顯示，BMSCs在CPC表面伸展良好，融合度高，CPC支架材料顯示了良好的細胞生物相容性，對細胞的黏附伸展無明顯不良反應，可作為良好的細胞載體。

本研究將BMSCs制成細胞懸液（轉染有miRNA相關產品的細胞/未做轉染處理的細胞），并逐滴滴加到CPC支架材料的內在孔隙中，直至CPC支架材料飽和而沒有含細胞的培養液溢出。待BMSCs在CPC支架材料上發生黏附之后，可以正常地進行細胞遷移、增殖以及成骨活性的表達。將細胞/支架材料復合物盡快植入到動物體內，以保證充分的營養供應，同時細胞代謝產物可以快速排出，最終誘導新骨形成并建立周圍細胞間的信號傳導[12]。

異位成骨是指發生在皮下和肌肉內等非骨組織內的成骨現象。骨組織工程中運用最早、最多的異位成骨動物模型是裸鼠模型。裸鼠是一種免疫缺陷型動物，因其不含胸腺，可以忽略細胞來源以及載體材料與宿主之間的免疫排斥反應，常用于構建組織工程化骨模型[13]。

復合物植入裸鼠體內2周后，RT-PCR結果顯示antagomir-30d組ALP、OC及RUNX2成骨基因mRNA水平的相對表達量均顯著高于空白對照組及NC組，而空白對照組及NC組兩者之間并無明顯差異。這表明對BMSCs轉染無意義鏈不會造成在體內細胞成骨分化活性及骨形成能力的改變；而當轉染miR-30d的拮抗劑antagomir-30d后，各成骨基因表達量的顯著上調意味著antagomir-30d在體內可以促進BMSCs的成骨分化，進而促進裸鼠皮下異位成骨，間接證明miR-30d的骨抑制作用。這與前期研究結果[14]以及本課題組體外實驗[1]結果一致。

植入4周后取出植入體行硬組織切片及組織形態學觀察，組織學苦味酸品紅染色結果顯示空白對照組與NC組未見新骨形成，antagomir-30d組可見微量新骨形成，組織形態學計量新骨形成面積為1.28%±0.19%。之前有研究[15]顯示CPC與BMSCs（接種密度為2×107個/mL）聯合培養植入裸鼠皮下4周后，其組織學染色結果表明可有少量新骨形成，新骨面積百分比為9.10%±5.75%。本次空白對照組（未做轉染處理的BMSCs+CPC）未見新骨形成的實驗結果與文獻報道有些許差異，這可能與種子細胞的使用代數、生長狀態、初始接種密度、與CPC支架材料的黏附情況等有關。

8周植入體硬組織切片及組織形態學計量結果顯示空白對照組和NC組已有明顯新骨形成，而antagomir-30d組新骨形成與4周時相比大大增加，新生骨滲透整個CPC支架材料。空白對照組新骨面積百分比為2.33%±0.52%，NC組新骨面積百分比為1.82%±0.53%，二者無顯著性差異，而antagomir-30d組新骨面積百分比明顯高于空白對照組與NC組，達到17.79%±1.15%。有文獻報道相似的體內異位成骨實驗[16]表明種子細胞初始接種濃度為5× 107個/mL時，8周組織學檢測BMSCs+CPC的實驗組新骨形成明顯，新骨面積百分比較高，可達約17%。

綜上所述，本研究構建的骨生長調控因子miRNA+種子細胞BMSCs+生物支架材料CPC的組織工程骨，應用于裸鼠體內異位成骨模型取得了較為理想的實驗結果，在體內初步驗證了miR-30d對骨形成的負性調控作用。該動物模型的建立將有利于增加對miRNA成骨調控機制的理解，并為miRNA的體內應用提供理論與實驗指導。