HMGB1及其調控牙周病發生發展的研究進展

李 瑩 趙宇琪 盛羽佳 王愛芹

濱州醫學院附屬醫院口腔內科，山東濱州 256600

高遷移率族蛋白1（high-mobility group box 1，HMGB1）是一種較保守的染色質結合蛋白，在細胞中參與調節DNA轉錄、翻譯及修飾，在細胞外與免疫細胞表面特定的受體結合，參與激活免疫細胞發生趨化、免疫調節等一系列級聯反應[1]。牙周病（periodontal diease，PD）是一類病因廣，發病機制復雜的口腔疾病。當牙周組織受到外源性刺激時，可造成組織內環境穩態失調，激活釋放多種炎癥因子參與調控PD發展。HMGB1作為一種晚期炎癥介質與模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）如TLR2、TLR4、RAGE結合進行一系列組織與細胞的級連反應[2]。國內學者首次[3]用HMGB1刺激人牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament cells，PDLCs）時發現調控牙周病發展的關鍵蛋白：白介素-6（interleukin-6，IL-6）及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達升高，同時低濃度HMGB1對hPDLCs具有促進增值作用，高濃度HMGB1蛋白則起到抑制作用，說明HMGB1參與調控牙周炎發生發展過程。因此本文將從HMGB1蛋白的結構特點及表達分布、釋放、生物學作用以及其如何參與調控牙周病發生發展等方面做一綜述，便于更全面掌握牙周病的發病機制，為此類疾病提供更具有針對性的治療思路。

1 HMGB1的結構特點及表達分布

HMGB1是一類結構穩定、半衰期較長的DNA結合蛋白，由215個氨基酸殘基組成，包括兩個同源的DNA結合結構域（A-box、B-box）以及一個帶負電荷的C-末端酸性尾巴（羧基末端）[1]。HMGB1的兩個結構域都有明顯的解旋與彎曲不同性質DNA的能力；B-box區域可結合微環及彎曲線性DNA，A-box可識別前彎曲或線性DNA[4]。當細胞受到外源性刺激時B-box誘導促炎信號，A-box則拮抗炎癥信號，C-末端作為轉錄激活劑發揮作用[5]。此外HMGB1的初級結構高度保守。HMGB1蛋白在多種組織中分布且表達量高，但其具體分布還取決于組織類型、蛋白氧化還原狀態、細胞分化階段。像胸腺、睪丸、脾等組織中的HMGB1在細胞核及細胞質分布表達。大腦、肝臟組織中的HMGB1則在胞漿表達[6]。研究還發現HMGB1在低分化的細胞、異常增殖及分裂活躍的細胞中表達處于高水平[7]。另外HMGB1的結構決定其功能，當HMGB1的結構失穩（螺旋臂相互作用破壞）會導致其功能狀態由沉默轉向活躍。

2 HMGB1的釋放

2.1 翻譯后修飾調控HMGB1的釋放

當HMGB1氨基酸殘基發生乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化、氧化、乳酸化等翻譯后修飾形式時，會減弱其與胞核DNA的親和力并促進釋放[8]。研究發現小鼠巨噬細胞RAW264.7和人單核細胞經磷酸酶抑制劑（TNF-α）處理后HMGB1發生磷酸化并移位到細胞質，隨后分泌到細胞外[9]。HMGB1乙酰化是目前研究最多的HMGB1修飾類型之一，有學者發現乳酸可通過抑制沉默信息調節因子2相關酶1（sirt1）活性，同時募集乙酰化酶P300和環腺苷酸反應元件結合蛋白（CREB）到胞核，共同誘導HMGB1乙酰化[10]。近期的研究發現二甲雙胍、白藜蘆醇及姜黃素等藥物都是通過增強sirt1酶活性來減少HMGB1釋放[11]，提示sirt1可能是調控HMGB1乙酰化的重要蛋白。HMGB1甲基化是指LYS-42殘基發生甲基化，導致HMGB1的A-box區域構象異常，削弱其與核內DNA親和力以及抗炎能力。HMGB1糖基化與前三種修飾有所不同，HMGB1糖基化是在外源性刺激如脂多糖（LPS）的介導下，通過降低HMGB1與DNA結合能力及增加與核出口蛋白CRM1結合而致HMGB1向胞漿和胞外分泌[8]。

2.2 氧化狀態調控HMGB1的釋放

HMGB1的釋放還依賴氨基酸殘基的氧化狀態，氨基酸殘基cys23、cys45、cys106的氧化還原程度可調控HMGB1分子構象的改變[12]。正常情況下三個氨基酸殘基以完全還原狀態存在于不活躍的細胞中；當cys23、cys45發生氧化時則誘導HMGB1的A-box結構域螺旋Ⅰ、Ⅱ間發生位移，降低蛋白與核內DNA的親和力，導致HMGB1向胞質移位；cys106的氧化對于HMGB1胞漿移位也發揮重要作用[13]。由此看出控制HMGB1在胞內和胞外的氧化狀態有利于阻斷HMGB1的分泌；故尋找針對HMGB1的氧化還原劑可能是此蛋白參與的炎癥反應治療的關鍵。

3 HMGB1生物學作用

HMGB1在正常情況下存在于細胞核中與DNA結合，參與染色體重塑，穩定核小體，進行DNA復制、重組、損傷、修復，調控轉錄因子活性及基因表達等一系列生理病理過程的調控[14]。當HMGB1分布到胞外時可調節內皮細胞活化、血管再生、骨髓干細胞遷移，還可與胞外受體結合介導相應的組織細胞級聯反應，另外HMGB1還可促進白細胞分化和活化，釋放炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）[15]，通過趨化及募集炎癥因子到易感部位加重炎癥。研究發現高濃度HMGB1可上調一氧化氮合酶活性及促進一氧化氮釋放，加重炎癥組織損傷[16]。這與前文中發現高濃度HMGB1可抑制牙周膜成纖維細胞增殖并加重牙周組織破壞這一結論相呼應。因此考慮HMGB1參與牙周病發生發展過程。

4 HMGB1參與PD的調控

4.1 HMGB1參與調節牙周骨組織代謝

牙槽骨吸收是PD發生發展過程中的一個重要病理改變，研究共識骨重建過程是受骨細胞生成和分泌的細胞因子及生長因子調控成骨細胞和破骨細胞活化及分化。有學者通過收集的牙周炎臨床標本發現牙周炎患者齦溝液中有HMGB1高表達，并且發現HMGB1與牙槽骨吸收程度存在正相關；以及在后續動物實驗中發現大鼠骨髓基質干細胞在HMGB1刺激下破骨細胞活躍，加速骨破壞進程，證實了HMGB1參與牙槽骨吸收過程[17]。另有學者研究發現[18]小鼠頜創傷區域的牙周組織中HMGB1高表達，并與破骨細胞核因子κB受體活化因子（RANKL）的表達呈正相關，提示HMGB1可能是通過上調RANKL的表達加速合創傷所致的骨吸收。此研究還表明HMGB1在無菌性炎癥中仍可參與骨吸收。有學者研究發現牙周炎患者齦溝液中引導骨礦化及骨新陳代謝標志物-骨涎蛋白（BSP）和反映骨代謝瞬間變化的激素樣蛋白-骨鈣蛋白（OC）的表達均上調。當予以HMGB1刺激后發現OC表達上調，說明HMGB1可能通過上調OC的表達促進牙周骨組織中破骨細胞分化；而BSP表達則下調，說明HMGB1通過下調BSP抑制牙周骨組織的修復和再礦化；但具體機制仍不清楚[19-21]。大量研究表明HMGB1對骨細胞和破骨細胞都有作用，并且這種作用可能是直接性的[22-24]。其中Davis等[22]通過體外實驗發現HMGB1通過與TLR2、TLR4、RAGE結合直接刺激破骨細胞導致其數量增加，當間接增加骨細胞的分泌時細胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達上調，這也意味著破骨細胞數量增加。根據上述多項研究發現HMGB1在PD發生發展過程中可以通過直接或間接的作用增加破骨細胞數量，加重PD的骨破壞程度。

4.2 HMGB1參與牙周炎癥反應及調節炎癥因子的分泌

HMGB1作為典型的損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）分子之一，在調節PD免疫反應中具有重要的作用[25]。多項臨床研究發現慢性牙周炎患者牙齦組織中HMGB1表達水平與外周血中致炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達呈正相關性，且均與牙周破壞程度呈正相關[26-27]。說明HMGB1可能通過調節促炎細胞因子的表達分泌推動牙周炎癥的發展。Nogueira等[28]通過體外研究發現經脂多糖或IL-1β刺激小鼠牙周膜成纖維細胞可導致HMGB1表達上調，且呈劑量依賴性增加。Ito等[29]發現IL-1β以一氧化氮依賴的方式促進人牙齦上皮細胞（human gingival epithelial cells，hGECs）中HMGB1的表達，并隨時間產生正向調控的作用，提示HMGB1/INOS（一氧化氮合酶）信號軸在炎癥狀態下的hGECs中起作用，并參與PD發展。當牙周組織持續受到病原菌的刺激時，組織細胞不斷分泌HMGB1，使巨噬細胞進一步活化聚合為多核巨細胞（又名破骨前體細胞）誘導破骨細胞分化，參與骨吸收與分泌炎癥因子，放大牙周炎癥的破壞。而這一過程可以被抗HMGB1抗體抑制[23]。提示HMGB1在PD發展過程中既可以激活免疫細胞分泌炎癥因子，進行組織修復過程；也可通過誘導巨噬細胞分化，增加破骨細胞數量，破壞牙周骨組織；同時也可作為牙周病的一個治療靶點。總結來說，胞外的HMGB1通過調節炎癥因子的分泌并將它們募集到病變部位參與牙周炎癥的發展。

另外研究發現將牙周膜細胞與巨噬細胞共培養時活化的破骨細胞數量增多，而破骨細胞活躍也代表骨重建的開始，說明釋放的HMGB1可能不僅是一種促炎因子，還可能在牙周損傷修復中也具有一定的促進作用[28]。故進一步確定HMGB1可以作為牙周病的治療靶點。

4.3 HMGB1參與牙周免疫反應及細胞自噬過程

近年來人們關注到自噬在宿主免疫反應中具有重要的作用：能夠直接清除微生物、調節炎癥、先天免疫與適應性免疫以及牙槽骨重建[30]。多項研究表明自噬可能參與牙周炎的發病機制，Bullon等[31]較早報道慢性牙周炎患者的外周血單核細胞中線粒體活性氧（ROS）和自噬標志蛋白LC3表達呈正向增加。Lee等[32]通過體外實驗發現用Pg.LPS刺激人牙齦上皮細胞，自噬相關蛋白Atg12和標志蛋白LC3的表達上調，自噬體數量增加。用腫瘤壞死因子（TNF）刺激牙周韌帶干細胞，蛋白免疫印跡實驗結果表明LC3表達水平上調[33]。

此外，DAMP與內源性和外源性配體結合可引發多蛋白信號轉導級聯過程，調節免疫反應。因此對于自噬調控DAMP，如HMGB1釋放、DNA損傷等方面的研究引起了眾多學者的關注。在受到內毒素刺激的巨噬細胞中自噬可誘發內吞作用導致內源性HMGB1降解抑制炎癥反應[34]。研究發現齦下菌斑中有高濃度的丁酸鹽可誘發自噬，使HMGB1從牙齦上皮細胞中釋放到胞外環境中[35]。牙周免疫反應與自噬過程存在多個交叉點，在推動病變發展過程中具有協同作用。自噬通過宿主表面的PRRs（如TLR受體）負向調控炎癥因子的分泌，同時活性氧含量累積，進而造成組織細胞壞死[36]，而細胞壞死會導致HMGB1胞外釋放增加，故這一循壞過程一直持續在PD發生發展過程中。由此看來HMGB1不僅參與牙周免疫反應、調節骨代謝、調控炎癥因子的分泌，還參與自噬過程；能確認的一點是HMGB1既參與牙周免疫反應也參與自噬過程，但其調控自噬的具體機制仍不明確，還需更多基礎實驗探索。

5 小結與展望

綜上所述，HMGB1能通過調節骨代謝促進破骨細胞分化與活化，通過增加炎癥因子分泌間接增加破骨細胞數量，參與炎癥反應及調節炎癥因子分泌和參與細胞自噬及免疫反應來調控牙周病發生發展，揭示了HMGB1可以作為牙周病的治療靶點。目前已有藥物通過調節HMGB1的表達而減輕牙周炎病理性破壞，如二甲雙胍可以有效減輕實驗性大鼠牙周炎的氧化應激、牙槽骨破壞及炎癥因子的表達[37]；甘草酸抑制HMGB1表達，減輕受RAGE調控的TNF-α、IL-6的表達，減輕實驗性糖尿病性牙周炎的牙槽骨吸收及炎性破壞[38]；同樣黃芩苷也是通過調控HMGB1表達，抑制其胞外受體相關信號分子表達，減輕牙周炎癥及骨破壞[39]。從這些研究中不難看出HMGB1在牙周病發展中的關鍵性作用，同時應該注意到臨床中牙周病多與系統性疾病伴發，所以未來應多關注一線臨床用藥對HMGB1的調控機制，可以減少多發疾病型患者的用藥種類，讓藥物的作用發揮到最大值。