半月板運動損傷力學機制及差異基因分析

蒲磊 漆正堂

(華東師范大學體育與健康學院 上海 200241)

隨著經濟和社會的發展，人民生活水平的提高，運動及意外事故造成的半月板損傷成為膝關節的常見外傷性疾病之一。半月板是纖維軟骨板，位于脛骨內、外側髁關節面上，具有緩沖震動和保護膝蓋的功能。半月板損傷會導致膝關節及其以下關節活動受限。運動造成半月板損傷的常見因素是膝關節的突然制動和劇烈擺動等。因此，研究運動引起的半月板損傷的力學機制可以避免運動壽命降低和運動損傷的發生。由于學科的相互交叉滲透及不斷發展，體育領域逐漸將基因組學相關研究方法與思路應用于運動損傷及各種疾病之中。目前而言，基于基因組學的運動損傷及干預措施的研究正逐步推進，針對運動造成半月板損傷的DEGs分析仍較少。回顧性研究發現，半月板發生損傷后，不及時康復治療，損傷會積累，繼而影響相關生理功能，即使治療后，伴隨著年齡的增長，半月板損傷也會引起并發癥，如關節積液、骨關節炎、滑膜炎等。因此，利用生物信息學方法探索不同年齡段的DEGs，提供半月板損傷的基因靶點，可能對延緩、預防疾病具有一定的價值。

1 制動導致半月板損傷的機制

半月板是膝關節的重要軟骨組織，由于特殊的生理位置及功能，運動造成的半月板損傷成為常見的運動性疾病。制動在運動過程中發揮著重要作用，動量矩在身體內傳遞和轉移就是利用某些身體環節的突然制動，從而使環節原已獲得的動量矩向相鄰環節轉移和傳遞，然而制動又是導致半月板損傷的主要原因之一。運動時，身體處于變化狀態，重心也隨之變化，當身體急劇制動，重心未及時調整時，半月板在股骨髁與脛骨之間發生研磨，半月板受到壓縮-扭轉復合載荷，導致損傷。例如，足球運動中，運動員為減少慣量，大、小腿折疊后急劇伸小腿作強力扭轉，此刻半月板處在股骨內外側髁、股骨的突起部位中間，未及時滑移，受到上、下關節面強烈沖擊和擠壓，導致損傷的發生。制動造成的半月板損傷主要表現為磨損與變性（改變性質）［1］。

其中，磨損分為兩類，即界面磨損和疲勞性磨損。界面磨損由承載表面之間的相互作用引起，疲勞性磨損由關節變形引起。承載面磨損的可能機制為半月板微結構受到破壞，正常加載機制（如分泌潤滑液）發生改變，表面研磨與粘黏，承載表面過于干涸而引發磨損。變形機制可能是，運動時，由于劇烈制動，半月板受到外力作用，內部產生對抗力，局部相對變形，繼續增加壓強，半月板受到過高載荷，未及時使組織間液重新分布與滑移，繼而因強烈碰撞導致半月板承載表面變形，最終引發疲勞性磨損。

軟骨變性的可能機制為軟骨受到異常應力與應變，隨著應力的增加，力的作用點集中，軟骨內產生斷裂，繼而引發軟骨變性與退化［2-3］。研究發現，制動后數日內，關節滑液分泌障礙，潤滑囊干涸、粘連、消失，關節軟骨接觸面的表層發生退行性變化，逐漸侵入各層，繼而引發軟骨細胞死亡、軟骨吸取營養功能障礙、纖維化等，最終導致關節粘連、關節攣縮、關節炎，引起關節活動障礙［4］。制動不僅能引起半月板單方面損傷，還會引起周圍韌帶的機械損傷，形成膝關節損傷。制動導致韌帶萎縮，韌帶應力、應變下降、機械性能降低，韌帶發生機械性損傷，最終關節穩固性下降?？傊?，劇烈運動增加了損傷發生的可能性，制動首先引起關節內壓強增大，應力、應變發生變化，所受載荷超出范圍，發生損傷，進而引發穩定性下降、軟骨細胞凋亡、功能異常等［5-7］。

2 半月板損傷的差異基因分析與討論

隨著細胞生物學和生物信息學的發展，基因組學的調控療法逐漸被應用于運動損傷及各種疾病之中。目前而言，基于基因組學的運動損傷研究及干預措施正逐步推進?；仡櫺匝芯堪l現，針對運動造成半月板損傷的DEGs分析仍較少。游茗柯等人［8］的研究報道，血管內皮生長因子（VEGF）、軟骨素酶-ABC、硫酸軟骨素（CS）、白細胞介素-1（IL-1）、胰島素樣生因子-1（IGF-1）等，對于半月板損傷的治療具有重要意義。國內研究者賈瓊通過建立大鼠半月板損傷模型，分析腫瘤壞死因子（TNF-α）和超級生長因子TGF-β1 基因在半月板受損后的差異表達，發現TNF-α 的正負調控和TGF-β1 在軟骨組織的維持和修復作用，可用于治療、保護關節軟骨。雖然大量研究證明基因表達與半月板損傷的發展相關，但半月板患者在不同年齡段病理變化的差異基因表達尚不清楚。

該研究通過GEO數據庫下載了GSE45233基因集，數據源采集年齡已劃分為＞40 歲和≤40 歲，據此，該研究將劃分為兩組：老年組/對照組（＞40 歲，6 人平均50歲，最大年齡55 歲，最小年齡43 歲）和年輕組/實驗組（≤40 歲，6 人平均30 歲，最大年齡40 歲，最小年齡16歲）。利用GEO2R在線數據庫分析GSE45233，并以P＜0.05和logFC絕對值≥1作為篩選標準，共篩選出290個上調差異基因（DEGs）和235 個下調DEGs，并運用UE和R軟件繪制火山圖（見圖1）。

圖1 DEGs火山圖

然后，利用DAVID 數據庫進行上調、下調DEGs 的基因本體功能（GO）的生物過程（BP）和京東與基因組百科全書（KEGG）富集分析。圖2 結果顯示，上調DEGs 在BP 中顯著富集于骨骼系統開發、膠原纖維組織、軟骨發育、軟骨凝結、軟骨細胞分化的負調控、軟骨內骨化、軟骨細胞分化等進程中。KEGG 通路中，上調基因顯著富集的通路共5條：蛋白質消化吸收通路、磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路、海馬信號通路、低氧誘導因子（HIF-1）信號通路和細胞外基質受體相互作用通路等。P13K-Akt是一類AGC 家族的蘇氨酸激酶，P13K/Akt 通路與人類疾病密切相關，如癌癥、骨關節炎、心血管疾病、神經疾病等，主要參與著調控細胞周期的多種環節，在細胞過程中發揮著關鍵作用。有研究探討了P13K/Akt信號通路的激活可減少細胞的凋亡、減輕心肌內皮細胞凋亡等，并認為上調P13K/Akt能夠減少肌細胞凋零，達到改善骨骼肌功能的效果［9］。李田洋等人［10］研究報道，P13K/Akt通路在骨關節炎軟骨細胞凋亡中發揮著重要作用，抑制P13K/Akt的磷酸化可促進軟骨細胞增殖，對延緩骨關節炎的發展和治療有良好的療效。大量研究表明，P13K/Akt通路參與細胞凋亡、調控細胞周期及軟骨組織疾病的發生和發展，據此，推斷半月板損傷加劇可能機制為PI3K/AKT通路表達量減少，軟骨細胞逐漸凋亡，伴隨白介素（IL-1β）誘導細胞凋亡和炎癥，軟骨細胞的一氧化碳和活性氧增加，半胱氨酸蛋白酶（Caspas-9/caspas-3）的產生和PI3K/Akt的磷酸化，最終引發半月板損傷惡化［11］。細胞外基質（ECM）指在多細胞有機體中，由細胞分泌至細胞外間質的大分子組成的復雜網絡。ECM 與多種疾病密切聯系，相關研究已證實ECM 基因突變可引發骨關節炎，黃斑變性病，動脈粥樣硬化等疾病。楊等人［11-12］建立兔子模型，發現ECM誘導血管化組織工程對于修復兔子的半月板損傷具有一定潛力。該數據集采集者研究報道，細胞外基質與年齡具有相關性，隨著年齡的增加，細胞外基質也發生變化，該研究篩選了與軟骨穩態和骨關節炎相關的基因，發現了隨年齡增長而發生上調和下調變化的基因，暗示了軟骨病或將隨著年齡而發生變化。這與該研究的富集分析結果不謀而合，上調DEGs基因集顯示7 個基因富集于ECM 通路，分別是：COL2A1、LAMB3、LAMC3、ITGA10、CHAD、COL9A3、COL9A2，這些基因與軟骨疾病密切相關，可為今后相關研究者提出大量實證。

圖2 上調DEGs的BP和KEGG 富集分析結果圖

圖3 顯示，下調DEGs 在BP 中顯著富集于細胞增殖，超氧化代謝過程，免疫應答，蛋白質磷酸化，白細胞介素-1β正調節，細胞凋亡過程，線粒體ATP合成耦合電子傳遞的正調控，細胞分裂，先天免疫反應等過程。下調DEGs 顯著富集于3 條通路，即破骨細胞分化、中性粒細胞胞外陷阱形成、B細胞受體信號通路。骨細胞分化通路是骨生成的重要通路，相關研究報道，骨的生成是破骨細胞（OC）與成骨細胞（OB）保持平衡相互作用的結果，二者失去平衡將引起骨疾病，OC 前體細胞向破骨細胞分化需要細胞因子的參與，如巨噬細胞集落刺激因子、核轉錄因子-κB受體活化因子等，其中調控NF-κB已被證實可促進關節炎軟骨再生［13-16］。中性粒細胞胞外陷阱（NET）指中性粒細胞（NEU）與感染性病原體作用后排出的細胞外DNA 鏈，NET 是血液中豐富的免疫細胞，參與著非感染炎癥的調控，NET也是消滅病原體，宿主抵御病原感染的關鍵點，其表達水平增多或減少都影響著急性、慢性疾病的病理過程［17-20］。B細胞受體（BCR）信號通路是B 細胞存活的重要信號通路，B 細胞在體液免疫中發揮著不可替代的作用，B 細胞膜表面表達著BCR，BCR 是能夠識別并結合抗原的免疫膜蛋白受體，進行BCR 調控對于多種免疫疾病具有重要治療意義［21-23］。

圖3 下調DEGs的BP和KEGG富集分析結果圖

最后，基于STRING數據庫利用Cytoscape（3.82）軟件分別構建了上調DEGs（見圖4）和下調DEGs（見圖5）的PPI 網絡圖，根據相關度（Degree）篩選出3 個上調關鍵基因和3 個下調關鍵基因。上調關鍵基因為VEGFA、FGF2、SOX9。下調關鍵基因為BIRC5、BUB1、CDK1。血管內皮生長因子A（VEGFA）是血小板衍生因子（PDGF）和血小板衍生生長因子（VEGF）家族的成員，該基因是血管生成的必要因子，在血管生成中誘導血管內皮細胞遷移和增殖，保護細胞避免凋亡和衰老［24］。成纖維細胞生長因子-2（FGF2）可促進細胞有絲分裂，刺激骨髓間充質干細胞（SMSCs）增殖并保持其多能性，間充質干細胞又是半月板細胞的有用來源，間充質干細胞可遷移至損傷部位，結合營養因子發揮修復功能，間接或直接改善半月板損傷。另外，袁媛等人通過建立牙髓模型，也發現FGF2預處理后可促進牙周膜干細胞的增殖及分化能力，對牙髓的再生發揮著重要作用［25-27］。SOX9是軟骨性轉錄因子，主要在間充質軟骨的形成過程中表達，對Aggrecan 和Co12a1 的轉錄發揮重要作用［28］。BIRC5該基因是凋亡抑制因子家族的成員，編碼抑制凋亡細胞死亡的負調節蛋白，李玉龍等人［29］研究發現結合相關因子，沉默BIRC5 可抑制細胞增殖，促進其凋亡，該基因主要應用于癌癥的靶點研究，但通過對其調控，應用于半月板損傷治療也具有一定潛力。BUBI是有絲分裂檢查點的重要成員之一，參與著有絲分裂過程微管與絲點結合的檢測，并在衰老、腫瘤、不孕等方面發揮著調控作用［30-31］。周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）是一套Ser/Thr 激酶系統，它對細胞周期調控、DNA損傷修復、檢查點的激活發揮著關鍵作用，CDK1 對細胞生存具有重要意義，目前已受到腫瘤研究的高度關注。

圖4 PPI上調DEGs網絡圖

圖5 PPI下調DEGs網絡圖

通過上述差異基因分析，該研究認為不同年齡段的半月板損傷發展具有差異性，對關鍵基因VFGFA、FGF2、SOX9、BIRC5、BUB1、CDK1的調控可能成為治療半月板損傷的靶點。例如，Grunewald等人［32］通過建立小鼠模型的研究發現，衰老過程中，盡管VEGF產生量未具有顯著性差異，但VEGF 在多個關鍵器官中的表達量顯著性減少；Joe.V等人以構建的小鼠模型為研究對象，發現了FGF2的表達水平會隨著年齡的增長而增加，FGF2 由于無法識別性地選擇激活休眠干細胞池，因此導致了干細胞被不必要地激活，而通過抑制FGF2表達量，可以有效地抑制小鼠體內干細胞數量的下降，這表明了隨著年齡的增長，干細胞池會被逐漸耗盡，進而導致干細胞數量下降［33］；Gruber 等人［34］研究發現，SOX9 的表達量與年齡成反比，即隨著年齡的增長，SOX9的表達量將會下降。相較于老年組而言，年輕組在半月板損傷的康復中可能更具有優勢，但由于基因表達水平較高，損傷及引發相關疾病的加劇速度也較快，因此針對不同年齡段應采用不同手段。老年組由于多種益于軟骨發育及修復的細胞逐漸凋亡的同時，促進病情加劇的相關細胞也隨之凋亡，可在病情極端惡化時進行靶點基因調控，促進軟骨再生及延緩。并制訂微量的體育鍛煉方案，提高肌肉性能，關節穩定性、靈活性，增加自身免疫力和消炎藥物輔以控制病情。而年輕組由于細胞凋亡與增殖因子及自身免疫系統因子正處于壯年期，不建議利用基因調控對其進行治療［35］?？刹捎眠m宜的運動進行康復鍛煉，適宜的體育鍛煉對軟骨具有積極的影響，如抗阻運動，通過增大肌肉體積來提高關節負載能力，同時減少與軟骨之間的摩擦阻力，進而發揮間接性治療作用。

3 結語

該研究認為，制動會造成半月板磨損、變性，避免劇烈制動可防止損傷發生，一旦損傷發生，可根據病情發展及患者年齡等情況采取針對性治療方法。

該研究為綜述性研究，其確切結論及機制仍需更進一步臨床研究證實，研究過程中發現了諸如KIF11及多種雌激素基因的反復出現，暗示了可能還受到性別影響，遺憾的是，基因集數據并未對此分類，相關影響因素有待進一步探討。