一起鵝源番鴨呼腸孤病毒的分離鑒定

武世珍，靖吉強，李 舫，宋莎莎

（山東畜牧獸醫職業學院，山東 濰坊 261061）

山東養鵝業不斷發展，取得了很大成績。近幾年來，雛鵝肝臟、脾臟出現密集性灰白色壞死灶的病例不斷增多。雛鵝發病率 3 %～60 %，病死率有時達80 %，該病不斷蔓延，危害較大。為了尋找病因，筆者對病鵝進行了病料采集、病原分離鑒定，并對防控措施進行了探討，為發病鵝場有效控制該病提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

病料采集：2020年5月，山東菏澤一鵝場飼養15日齡三花鵝1 400只，地面平養，鵝群中大部分鵝精神、食欲、運動基本正常，但少數鵝縮頭、閉眼，食欲下降，排黃白色稀糞，陸續死亡。該鵝群未免疫呼腸孤病毒疫苗。剖檢病鵝，可見肝臟、脾臟表面有密集性灰白色壞死灶，膽囊充盈，胰腺出血，心肌及心冠脂肪出血，病程長者出現心包炎、肝周炎。采集僅有壞死灶的鵝肝臟進行病原分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病料觸片，美蘭染色，鏡檢 用滅菌的剪刀剪開肝臟，用肝臟的新鮮斷面做觸片，干燥固定，美蘭染色，用顯微鏡油鏡檢查。

1.2.2 細菌分離培養 在肝臟表面用燒紅的烙刀做一烙印，用接種環從烙印中央插入肝臟取病料，分別接種鮮血瓊脂培養基，尹紅美蘭培養基，37 ℃ 培養18 h，觀察結果。

1.2.3 病毒分離培養 將鵝肝臟剪碎，按 1:4體積加滅菌生理鹽水，用滅菌勻漿器勻漿，液體裝入滅菌離心管，反復凍融 3次。4 ℃、10 000×g離心 30 min，吸取上清液，用細菌濾器過濾除菌。取濾液接種 10日齡雞胚 15枚，尿囊腔接種，接種量為0.15 ml/枚。接種后，37 ℃ 恒溫孵化，棄去24 h內死亡的雞胚。每間隔6 h觀察1次，孵化至第 4天，把試驗接種胚冷藏保存24 h。消毒雞胚氣室部，打開雞胚，觀察胚體，收取尿囊液，記錄結果。

1.2.4 病毒的血凝抑制試驗 根據 GB/T 16550-2008《新城疫診斷技術》，利用收取的尿囊液做病毒的血凝及血凝抑制試驗。

1.2.5 引物合成 檢測鵝源呼腸孤病毒引物，根據呼腸孤病毒 σC蛋白基因設計合成，上游引物P1：5'-GCACTCTGGATCCAGTAC-3'，下游引物P2：5'-CAATGGAGAAGCGAACCG-3'，目的片段大小為 438 bp。禽流感引物參考 GB/T 18936-2020《高致病性禽流感診斷技術》，檢測 M 基因，F1: 5'-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'；F2:5'-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3'，目的片段大小為229 bp引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.6 RT-PCR檢測 按 TRIzol說明書提取病毒RNA，采用 RT-PCR技術檢測呼腸孤病毒、禽流感病毒。參考DB37/T 3821-2019《鴨新型呼腸孤病毒病診斷技術規范》，反轉錄（RT）反應主要步驟為：在 PCR管中加入 dNTP（10 mmol/L）0.8 μl，引物 P1（20 μmol/L）0.5 μl，引物 P2（20 μmol/L）0.5 μl，RNA 5.0 μl，70 ℃ 作用5 min，然后冰浴 1～2 min，再加入 RNA酶抑制劑 （ 40 U/μl） 0.5 μl， 反 轉 錄 酶 M-MLV（200 U/μl）0.7 μl，5×M-MLV buffer 2 μl，混勻后 42 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min。PCR 反應體系：10×PCR buffer 5 μl，引物 P1（20 μmo1/L）0.5 μl，引物 P2（20 μmo1/L）0.5 μl，RT 產物，5.0 μl；Taq E（5 U/μl），0.5 μl；雙蒸水 38.5 μl。PCR 反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，共進行 30個循環；最后 72 ℃延伸 10 min。參考 GB/T 18936-2020《高致病性禽流感診斷技術》，主要步驟如下，取 2.5 μl（約250 ng）提取的 RNA，加入RT-PCR反應液中，混勻后置于 PCR儀中，循環參數為；45 ℃，45 min；94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、68 ℃ 45 s；35個循環；最后68 ℃ 延伸8 min。

1.2.7 健康雛鵝接種試驗 飼養健康鵝 20只，分成試驗組和對照組，每組 10只。試驗組接種10倍稀釋的尿囊液0.2 ml，連續觀察10 d，記錄發病情況。對照組鵝注射滅菌生理鹽水0.2 ml/只。

2 結果與分析

2.1 病料觸片，染色，鏡檢

將染色后的玻片，在染色區域滴加香柏油，顯微鏡油鏡檢查，未見形狀規則的細菌。

2.2 細菌分離培養

37 ℃培養 18 h，血瓊脂培養基，尹紅美蘭培養基表面均未見細菌生長。

2.3 病毒分離培養

尿囊腔接種后，雞胚陸續死亡，胚體不同程度的出血。尿囊液清澈，不渾濁。

2.4 病毒的血凝抑制試驗

利用新城疫病毒陽性血清做 HI試驗，抗體效價為0，未檢測到新城疫病毒。

2.5 RT-PCR檢測結果

將 PCR產物進行電泳，檢測到鵝源呼腸孤病毒引物擴增出438 bp的目標片段，見圖1。

圖1 RT-PCR擴增鵝呼腸孤病毒基因的電泳圖

將 PCR產物送上海生工進行測序。將所得序列在 NCBI數據庫進行比對，比對結果表明：該序列與部分番鴨源呼腸孤病毒的核酸一致性在98 %～100 %。說明該病毒和番鴨源呼腸孤病毒的同源性較近。核酸比對結果見圖2。從系統進化樹可看出：本試驗分離到的鵝源呼腸孤病毒與2018年在德國境內綠頭野鴨體內分離到的禽呼腸孤病毒核酸同源性最遠，與 2019年南京農業大學從櫻桃鴨分離到的鴨源呼腸孤病毒核酸同源性較近，同 2020年中國農業大學從番鴨體內分離的呼腸孤病的核酸同源性稍遠。由此可推測，呼腸孤病毒在國內鴨、鵝、番鴨和綠頭鴨之間存在交互感染的趨勢，其致病性和抗原變化值得關注。系統進化樹見圖3。禽流感病毒引物未擴增出目標片段，檢測結果為陰性。

圖2 核酸比對結果

圖3 系統進化樹

2.6 健康雛鵝接種試驗

雛鵝接種后，試驗組鵝逐漸出現精神沉郁，行動困難，有1只在接種后第5天死亡，剖檢后可見肝臟有密集的壞死灶。病變和臨床雛鵝病例的較為一致。對照組鵝無異常變化。

2.7 診斷結論

根據臨床表現和實驗室檢測結果，該群雛鵝初步診斷為鵝源番鴨呼腸孤病毒感染。

3 討論

呼腸孤病毒屬于雙鏈RNA病毒[1]，在自然界廣泛分布[2]，致病力的有明顯差異。番鴨呼腸孤病毒在福建、浙江等地造成番鴨肝臟、脾臟有灰白色壞死灶，導致免疫抑制，生長不良，癱瘓，死淘率升高[3]。

鵝源呼腸孤病毒可導致三花鵝、泰州鵝、馬岡鵝、陽江鵝等品種的雛鵝發病，由于呼腸孤病毒的不斷變異，近幾年新分離的呼腸孤病毒導致的鵝病變與王永坤等在 2002年報道的鵝出血性壞死性肝炎有了較大的區別，病理變化出現了多樣化。

鵝源番鴨呼腸孤病毒嚴重損傷鵝的肝臟、脾臟，導致鵝抗病力差，容易繼發感染鵝大腸桿菌病、鵝沙門氏菌病等。該病四季均發，2～4周齡的雛鵝發病最重，因此，做好育雛期間的飼養管理十分重要，特別是育雛舍保溫、通風和消毒。

加強種鵝檢疫，對種蛋、直腸拭子中鵝源番鴨呼腸孤病毒的核酸檢測，逐步凈化種鵝群。避免帶毒種蛋污染孵化設備，導致雛鵝早期感染。種蛋入孵前嚴格做好種蛋消毒；孵化場對孵化設備、場地、運輸車、工作人員等嚴格消毒程序；鵝場進雛前對育雛舍嚴格消毒。

免疫接種可減少本病的發生[5]。種鵝可用當地流行株制備鵝源番鴨呼腸孤病毒滅活疫苗進行免疫，種鵝在產蛋前 6周應用油乳劑滅活苗進行免疫，1個月后再加強免疫1次。雛鵝出殼后7d可用番鴨呼腸孤疫苗（CA株）進行首次免疫，雛鵝 30日齡時可加強免疫。加大疫苗研發投入，提升免疫效果，是當前面臨的重要任務。

鵝場發生該病時，飼料中添加多種維生素，用黃芪多糖、柴胡、當歸、白芍、白術（炒）、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜、夏草冬蟲等中藥組方治療；同時配合敏感抗生素，防止鵝大腸桿菌等細菌的繼發感染。