蘇 帥

（山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

馬立克氏病（Marek′s disease, MD）是由雞的馬立克氏病病毒（Marek′s disease virus，MDV）引起的雞的一種腫瘤性疾病，以淋巴細胞增生和腫瘤的形成為主要特征，以外周神經、生殖腺、臟器、免疫器官中單核細胞浸潤以及由于外周神經腫瘤細胞的集聚而引起的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征[1]。匈牙利著名的獸醫病理學家馬立克（Joseph Marek）在1907年首先報道了該病，英國科學家Biggs在1961年倡導開始使用馬立克氏病這一名稱。

上世紀 20~30年代，隨著商品雞的死亡數目的明顯增加，人們開始逐步關注MD。1967年，Churchill等首次報道從接種病雞細胞的培養物中分離到了皰疹病毒。1970年，Calnek等發現MDV可以以一種具有感染性的游離細胞形式從羽毛囊排出，由于 MDV在雞舍環境中能夠相對穩定存在，易感雞呼吸系統接觸到空氣中帶有病毒的灰塵或羽屑，都可以引起MD的自然傳播。

直到上世紀 80年代，對 MD腫瘤細胞的 T細胞特性，腫瘤誘導的成淋巴細胞樣細胞系的建立，疾病的溶細胞期和免疫抑制期的確定等研究取得了重大的科研成果。HVT與CVI988/Rispens等疫苗株的分離鑒定以及廣泛使用，更使得 MD成為第一個可以用疫苗免疫的腫瘤性疾病[2]。隨著 MDV不斷的遺傳變異，毒力不斷的增強，越來越多的疫苗也隨之被研制應用。疫苗免疫與病毒變異相互博弈，為了保障養禽業的健康發展，國內外專家學者一直聚焦MD的研究，尤其國內專家學者在 MD的流行變異、致病性以及免疫防控取得顯著的研究進展。

1 我國雞群MDV的流行和變異現狀

禽病學專家將 MDV分為弱毒、強毒、超強毒和特超強毒 4種不同毒力的致病毒株，其引起家禽的腫瘤率以及死亡率逐漸增強，其中超強毒和特超強毒在沒有免疫的雞群能夠導致 3月內全部死亡。雖然一些規模化養雞場的發病率稍低，但很多小型養雞場的發病雞群死亡率高達 20 %~ 30 %，給家禽養殖業造成巨大經濟損失。最新國內的報道已經證實了在我國吉林、河南、廣西雞群出現特超強毒，尤其今年上半年，蛋雞疾病的診斷已經顯示我國南方地區發生了一定程度的MD流行，經過分子生物學技術和基因組學鑒定，證實是 MD超強毒[3-4]。鑒于 MD較強的空氣傳播，其在國內的流行應該引起養殖業的重視。因此，我國雞群包括部分種雞群已經呈現毒力增強型 MDV的流行，盡管絕大部分病毒分離株是 MDV超強毒，但是通過主要致病基因序列（meq、pp38基因）分析證實 MDV特超強毒已經在國內雞群出現。然而，對于國內 MDV特超強毒的毒力判定依然有必要進行系統的動物試驗比較，尤其需要關注的是 MDV參考毒株的選擇以及評價試驗環境的影響。

2 養禽業對于有效防控MD的迫切需求

雖然隨著疫苗的免疫，MDV的毒力呈現不斷增強的趨勢，但是毫無疑問疫苗免疫仍然是防治MD的最有效途徑。因此，自從MDV被分離鑒定以來，相關的疫苗也由 HVT，SB1，逐漸發展成了 CVI988/Rispens。然而，CVI988/Rispens對于特超強毒甚至超強毒是不能夠提供良好的免疫保護的，因此，研制免疫效果優于 CVI988/Rispens的疫苗是國內外養禽業防控 MD的迫切需求。

3 MD疫苗的應用現狀與研制方向

由于 MDV毒力增強導致的嚴重損失，國外在上世紀 80年代開始使用 CVI988/Rispens，這也導致國外雞群在上世紀就出現了 MDV特超強毒，而國內引入CVI988/Rispens疫苗稍晚。當前臨床養殖主要是使用CVI988/Rispens疫苗免疫，但是由于疫苗種毒的來源以及傳代次數均有不同，臨床免疫效果也參差不齊。國內研制的一株MDV弱毒疫苗 CVTR株已經獲得新獸藥注冊證書，具有和CVI988/Rispens相當的免疫效果，也即將在臨床使用。世界范圍內對于MD防控的嚴峻形勢，促使專家學者研制 MD新型疫苗。MD一直使用的是活疫苗，雖然禽病學家研制過基因工程亞單位疫苗，但是免疫效果均不理想。因此，自 HVT以來，MD均是使用的活疫苗，HVT疫苗發明人美國Witter院士通過大量的研究證實了CVI988/Rispens對于特超強毒沒有理想的免疫保護，更為重要的是利用細胞傳代致弱毒力研制 MD疫苗的傳統方法篩選的 10余株疫苗候選株均沒有 CVI988/Rispens的免疫效果好，因此，得出了一個重要結論，利用細胞傳代致弱毒力研制MD活疫苗的方法已經到達MDV生物學極限，也宣告了這種傳統方法研制更好疫苗的希望比較迷茫[5]。利用基因工程技術研制 MD基因缺失疫苗提供了新的思路，研制的基因缺失疫苗具有良好的生物安全性和免疫效果。我國利用國內分離株率先成功研制了 SC9-1活疫苗，其利用細菌人工染色體技術以及同源重組技術缺失掉MDV的致病基因-meq，通過多次大規模臨床試驗以及不同品系雞的評價，證實具有比 CVI988/Rispens更好的免疫效果，2019年獲得新獸藥證書，目前已經在臨床應用[6-7]。

國內研制的基因缺失疫苗逐步取代 CVI988/Rispens疫苗是 MD疫苗使用的發展趨勢。疫苗的使用在追求免疫效果的同時也越來越關注生物安全、重視疫苗免疫對于疾病的凈化。

4 兼具生物安全與免疫保護優勢的新型MD疫苗

利用感染性克隆技術研制MD基因缺失疫苗具有缺失基因精準、疫苗毒株穩定且更利用研制載體疫苗等顯著優勢，但是基因組保留有氯霉素抗性基因，制約了MD基因缺失疫苗的出口。筆者利用細胞內自然重組技術結合電轉化細菌內純化篩選的基因工程技術，敲除掉MD雙基因缺失疫苗候選株中的氯霉素抗性基因，研制的MD基因缺失疫苗MDLV21株沒有抗性基因，而且其基因組具有能夠在細菌內穩定復制的優勢，保證了原始種毒的免疫原性，為載體疫苗的研制提供便利條件，相關研究已經授權國家發明專利[8]。MDLV21株活疫苗對于海蘭褐蛋雞的生長性能沒有任何影響。通過嚴格生物安全保障措施的動物試驗證實，MDLV21株活疫苗能夠對人工接種MDV超強毒的蛋雞提供完全的免疫保護，而且體重沒有降低；而人工接種 MDV超強毒的蛋雞100%發病，剖檢死亡雞可以看到明顯的腎臟、肝臟等器官腫瘤。MDLV21株活疫苗相比 CVI988/Rispens對于 MDV超強毒的免疫保護指數提高15 % 以上，免疫雞疫苗毒向外排毒的能力下降80 %，并且顯著抑制 MDV超強毒在免疫雞體內的復制，有極大提高了疫苗的生物安全性。

HVT重組載體疫苗對于雞群傳染性法氏囊病具有理想的免疫保護效果，目前在臨床已經較為廣泛的應用，但是其對于 MDV的免疫保護效果欠佳。國內外還沒有有效的 I型 MDV重組載體疫苗，MDLV21株活疫苗為重組載體疫苗的研制奠定了基礎，憑借成熟的基因編輯技術大大提高了疫苗研制的成功幾率，對于雞群多種病毒病的綜合免疫防控具有重要意義。

5 MD防控的發展趨勢

疫苗接種雖然可以防止腫瘤形成和死亡發生，但并不能阻止病毒的感染復制和流行傳播，因此不但不能消滅此病，還會伴隨著 MD疫苗的使用導致MDV毒力不斷增強，甚至呈現每20年MDV毒力增強一個級別的現象[9]。然而，這種規律受限于疫苗以及檢測技術的發展。包括CVI988/Rispens在內的各種MD疫苗其自身能在雞體內大量復制且向外排毒，并且不能夠有效的阻止野毒的增殖，因此，形成疫苗毒與野毒大量共存的現象，同時由于檢測技術的限制并不能準確鑒定野毒的感染，增加免疫壓力促使病毒變異的幾率。因此，長久的MD防控措施是理想的疫苗結合精準的檢測方法，以MD的凈化為最終目標。MDV基因缺失疫苗具有理想的免疫效力，其基因缺失位點同時提供了明確的與野毒鑒別區分的靶點。其中熒光定量PCR是最具應用價值的鑒別診斷方法，不但能夠有效區分疫苗毒與野毒，而且通過對疫苗毒與野毒的精確定量，明確雞群的免疫狀態以及野毒感染的發病進程，對于有效阻止 MDV野毒的擴散以及保障養禽業的健康發展具有重要的應用價值。

MD是雞群流行的“老病”，但是新的變異毒株不斷出現，世界范圍內蛋雞以及部分肉雞均需1日齡免疫 MD疫苗，隨著我國肉雞規模化養殖的快速發展，肉雞免疫MD疫苗也逐漸普遍。因此，MD疫苗具有廣闊的市場前景同時也面臨嚴峻挑戰。筆者基于我國雞MD研究現狀以及研究團隊最新的研究成果，對國內外 MD的防控進行了總結，為生物制品行業提供一株具有良好效果的MD疫苗，為面對今后更強毒力的MDV提供了可行的防控思路。