連續血液凈化對膿毒癥患者外周血NLRP3炎癥小體及腸道屏障功能的影響*

王鑫 成慧昕 李祥 于湘友 楊春波

(新疆醫科大學第一附屬醫院重癥醫學中心，新疆 烏魯木齊 830054)

膿毒癥是宿主對感染的反應失調而引起危及生命的器官功能障礙的疾病[1]?？股刂委?、感染源控制、液體復蘇及血管活性藥物的應用是目前膿毒癥治療的基石[2-4]，免疫治療、體外血液凈化等療法也被視為控制膿毒癥炎癥反應的輔助手段[3,5]。連續血液凈化(Continuous blood purification,CBP)可在一定程度上控制機體免疫系統的調節失衡、降低機體細胞因子風暴、減輕臟器功能損傷[6]。然而，大規模的RCT研究及Meta分析提示體外血液凈化治療并未顯著改善膿毒癥患者的臨床預后[7-9]。腸道既是膿毒癥的“始動因素”，也是膿毒癥器官損傷的靶點[10]。腸道內環境紊亂、微循環障礙、炎性因子風暴、腸道動力障礙、菌群失調及移位等因素共同作用，可加重腸道黏膜屏障的破壞[11]。在內源性及外源性刺激下，NOD樣受體家族核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NOD-like receptor family， pyrin domaincontaining 3，NLRP3)炎癥小體可通過同型相互作用招募ASC、caspase-1前體激活caspase-1，繼而引起促炎介質白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的成熟及釋放，促進炎癥反應[12]?，F有研究提示，NLRP3炎癥小體活化與膿毒癥導致的多器官損傷密切相關[13]。膿毒癥患者應用CBP治療對于腸道黏膜屏障功能的研究相對較少,缺乏相應的研究基礎，CBP治療是否影響NLRP3炎癥小體的研究缺乏理論支持。因此，本文就連續血液凈化治療對膿毒癥患者腸道屏障功能、NLRP3炎癥小體及臨床預后的影響進行探討和分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用前瞻性研究方法，納入2019年5月～2021年5月入住新疆醫科大學第一附屬醫院重癥醫學(ICU)中心的符合Sepsis 3.0標準[1]的膿毒癥患者作為研究對象。根據進行CBP治療將其分為膿毒癥常規治療組及膿毒癥CBP治療組。同時納入同期入住ICU的非膿毒癥患者作為對照組。 納入標準：年齡≥18周歲；膿毒癥組患者符合Sepsis 3.0的診斷標準；入住ICU時間≥3 d；取得患者或患者家屬的知情同意；臨床資料齊全。 排除標準：患者或家屬拒絕；既往存在慢性胃腸道疾病或伴有胃腸道惡性腫瘤；免疫系統疾病患者；入院72 h內死亡或自動出院者；妊娠或哺乳期患者。本研究作為前瞻性研究不對臨床治療進行干預，僅對不同組別的患者進行血液標本的收集，與患者或家屬充分溝通獲得同意后進行。本研究已通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(審批號：20200624-14)，并在中國臨床試驗注冊中心進行注冊且通過審核(注冊號：ChiCTR 2000040813)。本研究共納入100例，排除ICU住院時間<72 h(4例)、既往存在慢性胃腸道疾病(6例)、伴有胃腸道惡性腫瘤及孕產婦等(7例)，最終納入83例研究對象。其中非膿毒癥組24例、膿毒癥常規治療組35例、膿毒癥CBP治療組24例。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 收集3組患者各時點的第0、1、3天的外周血樣本：非膿毒癥患者在入住ICU第0、1、3天；膿毒癥常規治療組為診斷膿毒癥時的第0、1、3天；膿毒癥CBP治療組則為進行CRRT上機前(第1天)、經上機治療后第3天(清晨08∶00)進行血液標本的收集。

1.2.2 外周血淋巴細胞RNA提取及反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) RNA提取：相同時間點收集的外周血5 mL，提取外周血淋巴細胞中的NLRP3炎癥小體相關指標的RNA。引物的設計由生工生物工程(上海)股份有限公司在線設計。RT-PCR：應用SYBR法,體系為20 μL。混合引物為1.2 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，cDNA模板100ng，添無酶水至20 μL(所有操作均在冰上進行)。應用2-△△CT法計算NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC以及GAPDH的mRNA表達。

1.2.3 酶聯免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定血清相關指標 嚴格按ELISA試劑盒(武漢華美公司)說明書步驟操作，應用酶標儀進行測定及分析。測定指標包括腸道損傷指標血清腸型脂肪酸結合蛋白(Serum intestinal fatty acid binding protein，I-FABP)、炎癥因子IL-1β、IL-18的水平。

1.2.4 其他資料 IL-6、降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP)、肌酐、BUN等采用新疆醫科大學第一附屬醫院檢驗中心的數據。同時記錄入住ICU 24 h急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、入住ICU24 h內及第3天(或血液凈化治療后)的急性胃腸功能損傷 (Acute gastrointestinal injury，AGI)評分、年齡、基礎疾病等。電話隨訪患者28 d生存情況。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者在性別、BMI、基礎疾病(糖尿病除外)、感染部位(非膿毒癥組顱內感染占比較高)等方面比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；與非膿毒癥組相比，膿毒癥組常規治療、CBP治療年齡較小(P<0.05)；而膿毒癥CBP治療組的APACHEⅡ評分及28 d死亡率等方面明顯增高，差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 3組一般資料情況對比Table 1 Comparison of general information at ICU admission

2.2 3組患者臨床指標比較 組間比較：患者第1天與第3天，3組患者APACHEⅡ評分、PCT、IL-6、肌酐、BUN比較差異具有統計學意義(均P<0.05)，治療后第3天，3組患者血清NE%水平比較差異亦具有統計學意義(P<0.05)。組內比較：第3天非膿毒癥組患者CRP較第1天顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，第3天膿毒癥常規治療組、膿毒癥CPB組患者血乳酸含量較第1天明顯降低，且膿毒癥CPB組患者BUN相較于第1天明顯下降(P<0.05)，然而其余指標第3天較第1天相比，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 3組患者常見臨床指標的比較Table 2 Comparison of common clinical indicators in each group

2.3 3組患者外周血淋巴細胞中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的基因表達情況 組間比較：第1天，膿毒癥常規治療組和膿毒癥CBP治療組的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA水平較非膿毒癥組顯著升高，差異具有統計學意義(均P<0.05)。 組內比較：膿毒癥常規治療組患者第3天的NF-κB p65及NLRP3炎癥小體的mRNA水平較第1天相比有所升高，差異具有統計學意義(均P<0.05)，第3天膿毒癥CBP治療組患者各指標較第1天均有顯著下降，差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 3組患者PBL中NF-κB p65、NLRP3炎癥小體的mRNA水平比較Table 3 Mrna levels of NF-Κb P65 and NLRP3 inflammatory bodies in PBL of each group

2.4 3組患者外周血IL-1β、IL-18的水平 組間比較：第1天，膿毒癥CBP治療組的IL-1β與IL-18的水平顯著高于非膿毒癥組(均P<0.05)，而與膿毒癥常規治療組相比，僅有IL-18的水平較高(P<0.05)。第3天時，膿毒癥CBP治療組的IL-1β與IL-18均顯著高于非膿毒癥組；與膿毒癥常規治療組相比，膿毒癥CBP治療組的IL-1β有明顯增加。組內比較：膿毒癥常規治療組、膿毒癥CBP治療組第3天IL-18的水平較第1天均顯著降低(均P<0.05)，且膿毒癥CBP治療組患者第3天IL-1β水平較第1天下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。非膿毒癥組患者第1天與第3天各項指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 3組患者外周血IL-1β、IL-18的水平比較[M(P25,P75)，ng/L]Table 4 Comparison of il-1 β and IL-18 levels in peripheral blood

2.5 3組患者外周血I-FABP、AGI評分的比較 組間比較：膿毒癥常規治療、膿毒癥CBP治療組的I-FABP水平、AGI評分較非膿毒癥組均明顯增加(均P<0.05)；而膿毒癥CBP治療組的AGI評分在上述時點均顯著高于膿毒癥常規治療組(均P<0.05)。 組內比較：非膿毒癥組與膿毒癥常規治療組第3天各指標較第1天升高，但僅有膿毒癥常規治療組患者I-FABP水平變化差異具有統計學意義(P<0.05)，膿毒癥CBP治療組第3天的I-FABP水平與AGI評分較第1天明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 3組患者I-FABP、AGI評分的比較[M(P25,P75)]Table 5 Comparison ofI-FABP and AGI scores in each group

3 討論

膿毒癥是重癥醫學領域研究的常見病、多發病，對國家、社會及家庭造成了沉重的負擔，嚴重威脅人民的健康福祉。2020年我國ICU內膿毒癥的發病率為20.6%，較2014年發病率有所下降，但90天病死率仍高達35.5%[14]。研究發現NLRP3炎癥小體在膿毒癥所造成的腎、肝及肺等臟器損害中具有重要作用，近年來越來越多的研究將其做為膿毒癥治療的靶點之一[12,15]。本研究發現膿毒癥患者血清中IL-1β、IL-18均明顯高于非膿毒癥者，這與Garnacho等[16]得出的研究結果一致，進一步說明NLRP3炎癥小體活化參與膿毒癥發生發展。此外，本研究發現相較其他兩組，膿毒癥CBP治療組在上機前、上機后3天I-FABP、AGI評分顯著增高，同時NLRP3炎癥小體的mRNA的表達水平也進一步增加，提示膿毒癥疾病進展造成的胃腸道功能障礙可能與NLRP3炎癥小體活化有關。既往的研究也對此觀點進行論證，研究發現膿毒癥動物模型發生腸道屏障功能障礙時，存在腸道組織中的NLRP3炎癥小體表達升高[17-18]。同時Feng等[19]在抗生素誘導的腸道損傷的模型中發現， NLRP3炎癥小體在活化的同時伴有腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1降低，因此膿毒癥腸道功能障礙可能與腸道連接蛋白Occludin、Claudin-1表達減少及NLRP3炎癥小體活化有關。

目前，血液凈化治療已成為重癥患者重要的輔助治療手段，在臨床工作中應用廣泛，本研究發現膿毒癥CBP治療組經過治療后IL-6有所降低，但與上機前相比并無明顯差異，可能與本組患者的疾病仍處于進展當中或納入的樣本量過少有關。本研究結果顯示血液凈化降低了外周血淋巴細胞中的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的水平，提示血液凈化治療可以有效清除外周血淋巴細胞中NLRP3炎癥小體的水平。Bellomo等[20]于1993 年發現應用CVVHDF(持續靜脈-靜脈血液透析濾過) 可顯著降低膿毒癥合并急性腎衰竭患者的炎癥因子水平，如TNF-α、IL-1β。但Cole等[21]應用CVVH(2L/h)治療膿毒癥休克或存在器官功能不全的膿毒癥患者，結果提示許多炎癥因子水平降低與是否應用CVVH無關。但Zuccari等[22]在對膿毒癥/膿毒性休克患者應用CytoSorb進行CRRT治療中僅發現了IL-8明顯降低。一項納入22個國家130個中心的研究提示， CytoSorb(CS)吸附柱的應用可能降低膿毒癥患者IL-6的水平，但該研究觀察到的死亡率高達為65%[23-24]。

本研究發現膿毒癥CBP治療組的I-FABP、AGI評分較上機前有明顯的降低，提示連續血液凈化治療可能改善患者胃腸道功能，可能與其清除炎癥介質、減輕機體負荷有關與須欣等[25]的研究相符。此外，終末期腎病患者采用組合式血液凈化模式(HD+HDF+HP)可顯著降低終末期腎病患者炎癥因子水平，并可能通過改善體內微炎癥狀態來提供更好的腸道菌群多樣性，提示血液凈化對腸道具有一定的保護作用[26]。

本研究膿毒癥CBP治療組的28 d存活患者僅為29.17%(7/24)，明顯低于膿毒癥常規治療組，但該組患者APACHEⅡ評分較高及臨床結局較差，這可能與患者應用血液凈化啟動時機、感染嚴重程度以及其他臟器功能障礙等有關。血液凈化對膿毒癥患者的預后等方面由于本研究樣本量較少，亟需更多的RCT研究，以期明確血液凈化在膿毒癥中應用的價值。

4 結論

膿毒癥血液凈化治療可能減少外周血淋巴細胞中 NLRP3 炎癥小體的活化，繼而減少膿毒癥患者體內炎癥因子水平，改善膿毒癥患者胃腸道屏障功能。