健脾益腎泄濁湯大鼠灌腸的含藥血清對脂多糖誘導人結腸上皮細胞炎癥損傷模型的影響*

何玉華 瞿波 陳文 何金室 朱家恒 李明權

(成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072)

慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)是一種并發癥多，破壞性強，不可逆轉的疾病。近年來，諸多證據表明CKD患者的腸道微生物組與宿主的病理生理狀態相關[1-2]，有學者據此提出了“腸-腎軸(Gut-Kidney Axis)”理論[3]。該理論的核心觀點認為腸道與CKD之間存在雙向作用，一方面腎臟功能受損導致腸道菌群失調、腸道屏障功能破壞；另一方面腸道菌群及其代謝毒素通過受損的腸黏膜屏障入血，激活單核巨噬細胞系統，釋放大量細胞因子、炎癥因子、氧自由基等細胞毒性物質，誘發慢性炎癥，從而加速腎臟損傷。由此可知，腸道屏障功能受損是“腸-腎軸”致病過程中的關鍵環節。我國自20世紀60年代開始就把結腸作為中藥治療CKD的靶點，利用大腸傳導糟粕以降濁的功能特點，祛邪外達，調整陰陽，延緩疾病進展。本研究旨在通過觀察大鼠灌腸含藥血清對脂多糖誘導人結腸上皮細胞炎癥模型的干預效果，探討中藥灌腸對腸道機械屏障的影響，為中藥灌腸治療CKD提供更多理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 人正常結腸上皮細胞(NCM460，CL0172，豐暉生物)，SPF級SD大鼠，體質量(200±26)g。96孔細胞培養板(07-6096，山東Biologix)，6孔細胞培養板(07-6006，山東Biologix)，離心管(LPLXG，15 mL，杭州LABSELECT)，高糖培養基(DMEM，PM150210，武漢普諾賽)，胎牛血清(FBS，10100，500 mL，北京Gibco)，雙抗(SV30010，100 mL，美國HyClone)，胰酶(+EDTA，S310JV，100 mL，上海源培生物)，CCK-8(BS350B，5*100T，安徽Biosharp)，二甲基亞砜(DMSO，D5879，100 mL，美國Sigma-Aldrich)，PBS緩沖液干粉(201201A17，1L，上海遠慕生物)，Rat IL-6 ELISA KIT(ZC-36404，48Test，上海茁彩生物)，Rat TNF-α ELISA KIT(ZC-37624，48 Test，上海茁彩生物)，Western、IP細胞裂解液(P0013，上海Beyotime)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009，上海Beyotime)，PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG112，上海雅酶生物)，預染蛋白Marker(180kDa，RM19001，武漢ABClonal)，預染蛋白Marker(250kDa，26619，美國Thermo Fisher Scientific)，ECL發光試劑盒(KF001，江蘇Affinity Biosciences)，Immobilon-PSQ PVDF膜(ISEQ00010，美國Sigma-Aldrich)，Glycine (1275GR500，廣州Biofroxx)，Tris for molecular biology (1115GR500，廣州Biofroxx)，十二烷基磺酸鈉(SDS，1177GR500，廣州Biofroxx)，過硫酸銨溶液(天津市致遠化學試劑有限公司)，鹽酸異丙醇溶液(天津市致遠化學試劑有限公司)，ZO-1抗體(兔克隆抗體，AF5145，江蘇Affinity Biosciences)，Claudin1抗體(兔克隆抗體，AF0127，江蘇Affinity Biosciences)，Occludin抗體(兔克隆抗體，91131，美國Cell Signaling Technology)，β-actin抗體(兔克隆抗體，AC026，武漢ABClonal)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L，ab6721，英國Abcam)。

1.2 實驗設備 倒置生物顯微鏡(DMI1，德國LEICA)，臺式低速離心機(TDZ4-WS，長沙湘儀集團)，高速低溫離心機(H2050R，長沙湘儀集團)，二氧化碳培養箱(MCO-15AC，日本SANYO)，壓力蒸汽滅菌器(SYQ-DSX-280B，上海宜川儀表廠)，水浴鍋(HH-1，金壇市榮華儀器制造有限公司)，優譜超純水制造系統(UPH-II-10T，成都超純科技有限公司)，酶標儀(SpectraMAX Plus 384，美國Molecular Devices)，移液槍(2、10、20、200、1000 μL，北京大龍興創實驗儀器有限公司)，槍頭(20、200、1000 μL，美國Axygen)，EP管(1.5 mL、0.2 mL、100 μL，美國Axygen)，垂直電泳槽(JY-SCZ4+，北京君意東方電泳設備有限公司)，電泳儀(JY200C，北京君意東方電泳設備有限公司)，水平脫色搖床(TY-80A，江蘇科析儀器有限公司)，化學發光凝膠成像儀(5200，上海天能科技有限公司)，全功能酶標儀(MK3，美國Thermo Fisher Scientific)，超低溫冰箱(DW-86L386，海爾集團)。

1.3 方法

1.3.1 中藥灌腸液制備 課題組前期通過數據挖掘結果創立健脾益腎泄濁湯，含黃芪、大黃、煅牡蠣、蒲公英、丹參、附子。上述藥物均采購于成都中醫藥大學附屬醫院中藥房，中藥灌腸液由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑部自動煎藥機煎煮。

1.3.2 含藥血清提取 40只SPF級SD大鼠，隨機分為空白組、低劑量中藥灌腸組、中劑量中藥灌腸組、高劑量中藥灌腸組，每組10只。根據公式測算[4]并結合前期預實驗結果，空白組不予灌腸，低、中、高劑量組按1∶2∶4分別予0.4、0.8、1.6 mL中藥灌腸。大鼠固定于鼠板，頭朝斜下，尾朝斜上，露出肛門。藥液與大鼠肛門溫度相近(37.5～39℃)。將直頭灌腸軟管緩慢輕柔插入大鼠肛門，固定軟管，緩慢注射藥物，灌腸后予固定體位30 min。大鼠每天灌腸2次，連續灌腸5 d。于末次灌腸1 h后腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，收集上層血清，微孔濾膜過濾后置-80℃保存備用。

1.3.3 細胞培養 細胞復蘇:將NCM460細胞凍存管放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動管身，待凍存液融化后轉入超凈臺，轉移入15 mL離心管，按凍存液3倍體積加入新鮮培養基，250 g離心5 min，吸棄上清，加入新鮮培養基，放置孵箱培養。細胞傳代：吸棄舊培養基，用PBS洗滌2次，吸棄液體，加入孵溫的胰酶，輕晃培養瓶以使消化液完全浸潤細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，則加入胰酶體積3倍的新鮮培養基終止消化。將消化后的細胞轉移入15 mL離心管，250 g離心5 min，吸棄上清，加入新鮮培養基，以1∶3傳代培養。

1.3.4 細胞模型建立及分組 細胞分為空白組(Blank Group，BG)、模型組(Model Group，MG)、低劑量中藥灌腸血清組(Low-dose Enema Group，LDEG)、中劑量中藥灌腸血清組(Medium-dose Enema Group，MDEG)、高劑量中藥灌腸血清組(High-dose Enema Group，HDEG)。除空白組外，其余各組均加入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)100 μg/mL誘導細胞炎癥損傷。中藥灌腸血清組于加入LPS前2 h，將細胞培養液更換為10%含藥血清，模型組加入空白組大鼠血清，各組均孵育24 h后檢測相應指標。

1.3.5 CCK-8檢測細胞活性、抑制率 取對數生長期的NCM460細胞，經PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，250 g離心5 min，吸棄上清液，加入適量培養基使其成為單細胞懸液。調節細胞密度5×104/mL，100μL/孔接種于96孔板中(邊緣孔用無菌PBS填充)，37℃、5% CO2恒溫培養。待細胞貼壁后，設置空白組(BG)、模型組(MG)、低劑量中藥灌腸血清組(LDEG)、中劑量中藥灌腸血清組(MDEG)、高劑量中藥灌腸血清組(HDEG)，每組重復4個樣本。待藥物作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑， 37℃、5% CO2恒溫繼續培養2 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(OD值)。抑制率=(1-實驗組OD/空白組OD)×100%。

1.3.6 ELISA檢測細胞上清IL-6、TNF-α水平 將所有試劑平衡至室溫?？瞻讓φ湛撞患訕悠罚患语@色劑A、B和終止液；標準品孔，加入配好的標準品50 μL，然后加入辣根過氧化物酶100 μL。待測樣品孔，加入樣本50 μL，然后辣根過氧化物酶100 μL，蓋上封板膜，37℃溫育60 min。每孔加滿洗滌液，靜置1 min后吸棄，如此重復5次，拍干。顯色：每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。在15 min內，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.3.7 Western Blot檢測Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白水平 取NCM460細胞樣本，加入RIPA裂解液(細胞:裂解液=1:10)，裂解10min后收集裂解液，4℃、12000 rpm離心10 min。后取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。各實驗組取50 μL，按4∶1比例加入5×Loding buffer，混勻后熱循環儀95℃，15 min，-80℃保存。待積層膠凝固后拔出，置入電泳槽中電泳。將PVDF膜與分離膠同時放入轉膜液中平衡10 min。將凝膠面與負極相連，PVDF膜與正極相連，接通電源，200 mA轉膜1～2 h。將PVDF膜放入一抗(一抗濃度 ZO-1 1∶1000；Cladudin-1 1∶1000；Occludin 1∶1000；β-actin 1∶100000)，4℃孵育過夜。用TBST沖洗3次，后將PVDF膜放入二抗(稀釋濃度：1∶5000)，室溫孵育2～3 h，再次用TBST沖洗洗3次。滴加ECL發光液顯色曝光，用天能GIS機箱控制軟件V2.0對條帶進行曝光掃描，結果以目的蛋白相對表達量表示。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內參積分光密度值(IOD)。

2 結果

2.1 各組細胞活性、抑制率比較 經LPS造模后，細胞活性降低；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可增強炎癥損傷細胞的活性，但不同劑量之間的作用效果未見差異；LPS造模后，細胞抑制率增加；與空白血清干預相比，高劑量中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細胞的抑制率，低劑量與中劑量均未發現該效應。見表1。

表1 不同分組細胞OD、抑制率Table 1 Determination of OD value of cells in different groups

2.2 各組細胞上清IL-6、TNF-α比較 經LPS造模后，細胞上清IL-6水平升高；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細胞的上清IL-6水平，且高劑量的作用效果較低劑量與中劑量更為顯著。經LPS造模后，細胞上清TNF-α水平升高；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細胞的上清TNF-α水平，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。見表2。

表2 不同分組細胞IL-6、TNF-α比較Table 2 Determination of IL-6 in cells of different groups

2.3 各組細胞Claudin-1、Occludin、ZO-1相對表達量比較 經LPS造模后，細胞Claudin-1相對表達量下降；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細胞的Claudin-1相對表達量，且作用強度與劑量成正比。與BG相比，MG的Occludin相對表達量降低；與MG相比，LDEG、MDEG、HDEG的Occludin相對表達量升遍；LDEG與HDEG間的Occludin相對表達量比較差異有統計意義；LDEG與MDEG、MDEG 與HDEG之間的Occludin相對表達量比較差異無統計意義。結果表明，經LPS造模后，細胞Occludin相對表達量下降；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細胞的Occludin相對表達量，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。經LPS造模后，細胞ZO-1相對表達量下降；與空白血清干預相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細胞的ZO-1相對表達量，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。見圖1～3，表3。

圖2 不同分組細胞Occludin表達電泳圖Figure 2 Electrophoresis of Occludin expression in different groups of cells

圖3 不同分組細胞ZO-1表達電泳圖Figure 3 Electrophoresis of ZO-1 expression in different groups of cells

表3 不同分組細胞Claudin-1、Occludin、ZO-1相對表達量比較Table 3 Relative expression of Claudin-1 in cells of different groups

3 討論

本實驗基于“腸-腎軸”理論，以健脾益腎泄濁湯大鼠灌腸的含藥血清為干預手段，觀察人結腸上皮細胞腸道屏障相關蛋白及炎癥指標的變化，探討該方灌腸對腸道機械屏障以及局部炎癥狀態的影響。研究結果顯示，健脾益腎泄濁湯方灌腸含藥血清可增加炎癥損傷后NCM460細胞的OD值，增加Claudin-1、Occludin及ZO-1相對表達量，降低IL-6、TNF-α水平，且高劑量的效果更為顯著。

在腸道機械屏障功能正常的情況下，LPS無法進入血液循環，而CKD患者腸道黏膜通透性增高，LPS可借此移位進入血液循環，刺激炎癥細胞因子釋放，導致全身性炎癥狀態。多項研究證實了CKD患者/動物模型存在腸道機械屏障功能受損[5-7]。在體外試驗中，LPS/內毒素亦可引起內皮細胞損傷[8]。因此本實驗通過對NCM460細胞進行LPS造模，模擬CKD患者腸上皮細胞炎癥狀態。結果顯示，經LPS處理后，細胞抑制率升高，細胞活性下降，提示細胞損傷。同時，LPS能誘導細胞產生炎性因子，導致細胞上清IL-6、TNF-α水平均不同程度升高，與CKD患者的微炎癥狀態類似。

雖然中藥灌腸已廣泛應用于CKD的治療當中，但鮮有關于該法對腸道機械屏障功能影響的研究。腸道機械屏障，由腸上皮細胞和頂端連接復合體組成有濾過和屏蔽的雙向作用[9]。其中，緊密連接是頂端連接復合體最主要的連接方式[10]，主要由三個部分組成：粘附性跨膜蛋白，包括緊密連接蛋白(Claudin)和閉鎖蛋白(Occludin)家族；閉鎖小帶蛋白(Zonula Occluden，ZO)家族；肌動蛋白和肌球蛋白連接環。多項試驗表明，從緊密連接處去除Occludin，會降低緊密連接的穩定性，導致屏障功能受損[11-12]。Claudin多種異構體可以調節屏障功能[13]。本研究中，NCM460細胞經過LPS處理后，其緊密連接相關結構破壞，如Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達量均下降，提示腸上皮細胞屏障功能受損。其他動物實驗也發現，CKD大鼠空腸和回腸上皮緊密連接的關鍵蛋白成分(Claudin-1、Occludin)顯著減少[14]。本實驗采用的健脾益腎泄濁湯來自于前期數據挖掘結果，含黃芪(30g)、大黃(30g)、煅牡蠣(30g)、蒲公英(20g)、丹參(20g)、附子(10g)。實驗結果顯示，該方灌腸含藥血清較空白血清能顯著提高腸上皮細胞活性，減少IL-6、TNF-α含量，增加Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達。表明健脾益腎泄濁湯大鼠灌腸的含藥血清可以增強腸上皮細胞活性、增加腸上皮細胞間緊密連接相關蛋白的表達，可能有助于保護腸道機械屏障功能，從而減輕局部炎癥狀態。有研究者利用單藥大黃灌腸，同樣發現中藥灌腸能改善大鼠腸道機械屏障功能，調節腸道菌群失調，抑制全身炎癥反應，減輕腎纖維化[15]。鐘丹等[16]利用中藥復方(黃芪20 g、大黃30 g、牡蠣30 g、蒲公英30 g)對CKD大鼠模型灌腸，也發現通腑泄濁法能保護腸黏膜屏障功能?；謴湍c道機械屏障功能可有效阻止腸腔內的諸多有害物質，如微生物、微生物代謝毒素、炎癥因子等進入全身血液循環，理論上可減輕全身微炎癥狀態，減少腸源性毒素的蓄積，緩解尿毒癥毒素引起的臨床癥狀，延緩CKD持續進展。一項針對IgA腎病的臨床研究表明，經過4年的隨訪，腸道通透性增高患者的腎小球濾過率，其下降程度明顯大于腸道通透性正常的患者[17]。

當中藥灌腸液進入腸腔后，主要通過被動擴散吸收入血，因此藥液吸收量與藥液的體積和濃度密切相關。本實驗發現，與模型組相比，高劑量中藥灌腸組在多項指標中均具有統計學差異，并且在IL-6、Claudin-1中顯示了藥液劑量-效應關系。由此推導，在中藥灌腸的臨床應用當中，可提高藥液濃度，并在患者耐受程度內增加藥液劑量，以求最大療效。本研究采用了中藥復發制劑，藥物成分復雜，現有條件難以確定目標血藥濃度，因此無法進行精確的血藥濃度測算，僅以劑量的倍數1∶2∶4確定低、中、高劑量分組，所以并未在全部實驗指標中觀察到劑量-效應關系。另外，中藥煎煮工藝的干擾因素多，不同批次藥液的濃度參差不齊，難以保證藥物等效性，也是造成這一實驗現象的可能原因。

受限于時間及經費，本研究僅使用了Western blot檢測腸道緊密連接關鍵蛋白的表達，未使用實時熒光定量PCR進一步驗證。另外，本研究僅為細胞實驗，雖然結果表明中藥灌腸能夠一定程度的修復腸道機械屏障功能，但具體機制尚未可知。腸道通透性與腸道屏障功能相反，由于腸道黏膜必須同時促進水分和營養物質的運輸，同時起到保護屏障的作用，因此需要更多的研究去揭示這兩種功能的轉換機制。

目前，針對腸道上皮屏障損傷的最佳療法是治療基礎疾病，而靶向修復上皮細胞具有治療前景，包括腸道干細胞植入[18]以及增強上皮細胞擴增相關信號通路的表達[19]，但上述方法可能導致上皮細胞惡性增殖[20]。本研究發現健脾益腎泄濁湯灌腸的含藥血清能修復人結腸上皮細胞間的緊密連接，減輕局部炎癥狀態，對腸道機械屏障功能有一定的保護作用，理論上可延緩CKD進展。此外，闡明參與緊密連接調控的信號通路將有助于發現新的屏障修復劑，從而提供更加有效的CKD治療方法。

4 結論

健脾益腎泄濁湯大鼠灌腸的含藥血清可以增強腸上皮細胞活性，增加腸上皮細胞間緊密連接相關蛋白的表達，可能有助于保護腸道機械屏障功能，從而減輕局部炎癥狀態。