口蝦蛄總生物堿對人鼻咽癌CNE-2Z細胞周期與凋亡的影響*

齊相薇 林榮文 蔡康榮 王槐高

(廣東醫科大學 1.臨床技能培訓中心；2.科研中心；3.病理生理學教研室,廣東 東莞 523808)

目前我國鼻咽癌在中南部兩廣地區(廣東、廣西、湖南等)高發，隨著經濟發展及人口老齡化的出現，發病率可能還會上升；同時鼻咽癌的預后較差，死亡率也相對較高[1]。放射治療是目前鼻咽癌首選的治療手段, 調強放療技術可提高腫瘤靶區劑量,同時減少周圍正常組織照射劑量[2]，但是電離輻射殺滅腫瘤的同時，也可以誘導許多基因和蛋白質表達水平的變化，導致腫瘤對電離輻射的敏感性降低，并出現輻射抗性的發展[3]。鼻咽癌對放射治療比較敏感，患者的五年生存率可明顯提高，但放射治療同時會損傷患者頭頸部的其他組織，引起如頭暈頭痛、口干、聽力下降、頸部纖維化及放射性齲齒等多種毒副作用[4]，放射治療后復發率不低。臨床研究證明輔助化療聯合放療或聯合化療可改善鼻咽癌晚期患者的預后[5-6]。前期研究結果表明[7]，口蝦蛄乙酸乙酯提取物可能通過影響P53蛋白的表達,干擾COX-2和VEGF的表達而發揮抑制CNE-2Z細胞增殖。本研究根據新的提取方法獲得口蝦蛄總生物堿，觀察其對鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖、細胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和原料 人鼻咽癌CNE-2Z細胞由廣東醫科大學分子診斷重點實驗室提供。于海鮮市場購買新鮮口蝦蛄，經鑒定屬節肢動物門，甲殼綱，口足目，蝦蛄科品種。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養基購自GIBCO公司， Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁株式會社化學研究所，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，兔抗人Caspase8多抗購自Cell Signaling公司，鼠抗人β-actin單抗、羊抗兔、羊抗鼠 II 抗購自SIGMA公司，其余均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 口蝦蛄總生物堿提取及初步鑒定 以每公斤口蝦蛄加水3 L絞碎，酸化后，恒溫60℃浸泡過夜，離心后取上清液，調至pH>10。次日離心后取沉淀以乙酸乙酯分3次萃取，減壓濃縮得到總生物堿，具體操作方法參考前期研究結果[8-9]。總生物堿以氯仿-環乙烷(10∶1)溶劑薄層層析展開，采用改良碘化鉍鉀顯色初步定性分析。總生物堿以DMSO溶解分裝，臨用以培養液稀釋成所需濃度(DMSO的終濃度≤0.1%)。

1.2.2 分組 采用不同濃度(0、50、100 mg/L)的口蝦蛄總生物堿處理人鼻咽癌CNE-2Z細胞，分別記為對照組、50 mg/L組、100 mg/L組。

1.2.3 CCK-8檢測總生物堿細胞體外抗腫瘤作用 人鼻咽癌CNE-2Z細胞培養24 h后,制成單細胞懸液后調整細胞密度，滴入總生物堿溶液，使質量終濃度分別為5、25、125、625 mg/L，培養48 h并于終止培養前1 h，加CCK-8溶液混勻，孵育2 h后，進行CCK-8檢測，以試劑盒流程操作，取得細胞增殖抑制率。計算公式：抑制率%=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 平板克隆實驗法檢測總生物堿抑制細胞克隆形成能力 胰蛋白酶消化對數生長期CNE-2Z細胞制成細胞懸液，以每孔400個細胞接種于6孔細胞培養板，待細胞貼壁后，每孔換以0.1%胎牛血清的1640培養24 h，加入總生物堿調整終質量濃度(0、50、100 mg/L)，培養2周；PBS清洗細胞后甲醇固定0.5 h，結晶紫染色0.5 h，緩流清水沖洗后空置干燥；以網格透明膠片置培于培養板底部，低倍鏡計數大于10個細胞的克隆數，計算克隆形成率。計算公式：克隆形成率=(克隆形成數/接種總細胞數)×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測總生物堿對細胞周期分布的影響 胰蛋白酶消化對數生長期CNE-2Z細胞并制成細胞懸液，接種于6孔細胞培養板，待細胞貼壁后換培養基繼續培養24 h，加入總生物堿調整終質量濃度(0、50、100 mg/L)繼續培養24 h，每組重復3個培養孔；預冷的70%乙醇固定胰蛋白酶消化后收集細胞，保存于 4℃；次日離心，PBS洗滌后，以含質量終濃度碘化丙啶(PI)100 mg/L和RNase100 mg/L的染色液0.5 mL染色，在常溫下避光染色0.5 h，于流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗檢測Caspase8蛋白表達 人鼻咽癌CNE-2Z細胞培養24 h后,制成單細胞懸液后調整細胞密度，滴入總生物堿溶液，使質量終濃度分別為0、50、100 mg/L，培養24 h，加入裂解液，提取細胞總蛋白；選用BCA法測定蛋白濃度，調整蛋白樣品濃度均一后以SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白轉移到 PVDF 膜上，封閉2 h，加入 I 抗 [Caspase8(1∶500)]，保存于4℃封閉過夜；加入Ⅱ抗(1∶10 000)，室溫下搖動孵育2 h。以β-actin為內參照。Odyssey掃描成像后繼用Quantity one 軟件分析。

2 結果

2.1 口蝦蛄總生物堿薄層層析顯色結果 口蝦蛄總生物經薄層層析顯色，有4個顏色相同的色斑,為復合化合物，見圖1。顯色反應表明其化學性質為生物堿類物質。

圖1 薄層色譜法測定總生物堿結果Figure 1 Results of total alkaloid detected by TLC

2.2 口蝦蛄總生物堿抑制CNE-2Z細胞的增殖 不同質量濃度的總生物堿(5、25、125、625 mg/L)作用CNE-2Z細胞24、48、72 h后，與對照組相比，細胞的增殖受到明顯抑制。隨藥物濃度增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐步增加，具有明顯的劑量-時間-效應關系。采用Bliss算法軟件統計得到， 其作用于CNE-2Z細胞24、48和72 h的IC50分別為(578.17±0.65)mg/L、(86.27±0.73)mg/L和(63.31±0.35)mg/L，見圖2。

圖2 總生物堿對CNE-2Z細胞增殖的抑制作用Figure 2 Total alkaloid inhibited the proliferation of CNE-2Z cells

2.3 口蝦蛄總生物堿抑制CNE-2Z細胞的克隆形成能力 不同質量濃度的總生物堿(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z細胞，觀察細胞克隆形成能力的改變。與對照組相比，CNE-2Z細胞的克隆形成能力明顯降低；隨著總生物堿濃度的增加，其克隆形成數目和克隆形成大小均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 總生物堿抑制CNE-2Z細胞的克隆形成Figure 3 Total alkaloid suppressed colony formation of CNE-2Z cells注：與對照組相比，① P<0.05

2.4 口蝦蛄總生物堿對CNE-2Z細胞周期的影響 不同質量濃度的口蝦蛄總生物堿(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z細胞24 h后，流式細胞術檢測細胞周期分布的改變。與對照組相比，口蝦蛄總生物堿能誘導CNE-2Z細胞周期S期比例由11.7%上升為31.5%，而G0/G1期比例由85.5%下降為56%，呈一定的劑量依賴性，見圖4。提示口蝦蛄總生物堿能將CNE-2Z細胞周期阻滯于S期。

圖4 總生物堿作用后CNE-2Z細胞周期分布Figure 4 The effect of total alkaloid on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells注：與對照組相比，①P<0.05

2.5 口蝦蛄總生物堿對CNE-2Z細胞Caspase-8蛋白表達的影響 以總生物堿0、50、100 mg/L處理CNE-2Z細胞24 h后，與對照組比較，蛋白免疫印跡實驗檢測結果表明caspase-8酶原的蛋白表達隨濃度增加而減少，有一定的劑量依賴關系，見圖5。

圖5 總生物堿對CNE-2Z細胞Caspase8蛋白表達的影響Figure 5 The effect of total alkaloid on the expression of Caspase8 protein levels in the CNE-2Z cells

3 討論

海洋生態系統的高壓、高鹽、缺氧、低溫和低光照等獨特性賦予了海洋生物多樣、獨特和新穎的結構，是新藥研制開發藥物先導化合物的重要來源。海洋生物來源的具有抗腫瘤作用的多種化合物, 包括生物堿類、萜烯類、甾體類化合物、大環內酯類和多肽等，已經進入臨床不同的試驗階段或有相應產品上市[10-11]。

近年來從海洋微生物代謝產物中獲得眾多新的生物堿，其中部分生物堿具有高選擇性和高活性而備受關注[12-13]。有研究發現從高領類尖柳珊瑚Muriceides collaris中分離得到的一種愈創木薁倍半萜生物堿Muriceidine A體外對人宮頸腺癌細胞HeLa具有較強的細胞毒作用[14]。王亞楠等[15]從泰國紅樹林底泥中的耐酸真菌Aspergillus fumigatus OUCMDZ-5210的次生代謝產物中分離得到6個吲哚二酮哌嗪類生物堿，其中化合物3和6對人結腸癌細胞HCT116以及人慢性髓性白血病細胞K562具有不同程度的抑制活性。本研究所前期研究發現[16]，口蝦蛄乙酸乙酯提取物能抑制CNE-2Z細胞的增殖；進一步研究發現口蝦蛄乙酸乙酯提取物能夠抑制CNE-2Z細胞的遷移和體外血管生成擬態的能力，其機制可能與下調fascin1和VEGF蛋白的表達有關[17]。口蝦蛄乙酸乙酯提取物也可抑制HepG2細胞增殖并與順鉑聯合用藥可產生協同抑制效應[18]。早期研究通過系統溶劑法相繼得到口蝦蛄乙醇粗提物、正丁醇提取物，繼用乙酸乙酯萃取得到正丁醇提取物的總生物堿并進一步純化，其生物堿類化合物對鼻咽癌細胞增殖具有明顯的抑制作用[19]。綜合近年的研究結果，系統溶劑法有提取工藝繁瑣、溶劑及人力成本高及提取效率低下等缺點，有待改進。同時，口蝦蛄抗腫瘤物質活性雖強，但是體內腫瘤抑制實驗效果不佳，可能是由于系統溶法提取物，其成分、種類過于較復雜且含有抗腫瘤活性物質的量不高等原因引起的。尹田鵬等[20]采用酸提堿沉法，從貴州地區產烏頭中提取總生物堿浸膏并分離純化,獲得15個二萜類生物堿類成分。沙棘葉黃酮也可以先通過酸提堿沉法進一步純化得到[21]。故本研究采用酸提堿沉法結合乙酸乙酯萃取法，以探索提取更簡單、成份抗腫瘤活性更高的方法。本方法避免了乙醇提取法、系統溶劑提取法的繁瑣操作、溶劑、人力成本高等缺點，提取效率明顯提高，而且還可以直接純化總生物堿，提取物經薄層板色譜法初步鑒定為生物堿類物質。

口蝦蛄總生物堿處理后，CNE-2Z細胞的增殖受到明顯抑制，48 h的IC50較舊方法的乙酸乙酯提取物更低[22]。較以往研究，用更低質量終濃度50及100 mg/L的總生物堿就能明顯抑制CNE-2Z細胞克隆形成能力，使細胞周期阻滯于S期。Caspase-8是控制細胞凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡的分子開關[23]，是細胞死亡途徑的主要因子，活化的Caspase-8可以驅動經典的caspase依賴性凋亡[24]。唐旭東[25]發現用高三尖杉酯堿0、0.125、0.25、0.5和1 mg/L作用CNE-2Z細胞8 h后，Caspase-8酶原的蛋白表達隨濃度增加而減少，當濃度為1 mg/L時出現活性裂解片段,Caspase-8激活而誘導CNE-2Z細胞凋亡。本研究中總生物堿作用后CNE-2Z細胞后，Caspase-8蛋白的表達水平明顯下降，可能與Caspase-8激活有關，并可能繼而誘導凋亡，關于凋亡的全面觀察及具體機制有待進一步研究。

4 結論

口蝦蛄總生物堿抗CNE-2Z細胞的作用可能通過抑制細胞增殖、誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡等發生。