肖綺雯 石永杰 周強 黃思聰 康嘉樂 嘉紅云 彭永正

(1. 南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東 廣州 510280；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510260；3.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院輸血科，廣東 廣州 510280)

根據(jù)GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)，全球原發(fā)性肝癌年新發(fā)病數(shù)達905,677人，年新增死亡病例830,180人，在全球發(fā)病率中排名第五，在男性死亡率中排名第二；肝細胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)是原發(fā)性肝癌的主要類型[1]。LIHC患者預后差的主要原因是復發(fā)率高，且腫瘤干細胞(Cancer stem cells, CSCs)的存在被認為是肝癌復發(fā)的根本原因[2]。絲氨酸精氨酸蛋白激酶1(Serine arginine protein kinase 1，SRPK1)是一種mRNA前體的剪接因子，在睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤中高表達，并促進結腸癌、卵巢癌細胞的藥物抗性[3]，在非小細胞肺癌中能促進CSCs表型的積累[4]。此前，我們發(fā)現(xiàn)高表達SRPK1與肝細胞癌發(fā)展相關[5]，但其機制尚未完全闡明[6]。本研究中，我們進一步通過調控SRPK1在肝癌細胞株HepG2細胞的表達，研究SRPK1對HepG2細胞腫瘤干性影響，為以SRPK1為靶點的肝細胞癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 HepG2細胞于廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中心實驗室凍存，常規(guī)方法復蘇凍存細胞，采用體積分數(shù)5%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 mg/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、嘌呤霉素(美國Gibco公司)，表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素(美國PeproTech公司)，TBST緩沖液(美國Thermo Fisher公司)，ABI7500 Fast實時熒光定量PCR儀(美國applied biosystems公司)，Epics ALTRA流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，桌上離心機(德國sigma公司)。B27、DMEM/F12培養(yǎng)基、總RNA抽提試劑Trizol、Optim-MEM培養(yǎng)基、轉染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix(加拿大Fermentas公司)。兔抗人SRPK1(美國Abcam公司)，兔抗人GAPDH(美國Proteintech公司)，HRP-鼠二抗/HRP-兔二抗(美國Merck公司)。牛血清蛋白、熒光染料Hoechst33342、維拉帕米、碘化丙啶(美國Sigma-Aldrich公司)。調節(jié)SRPK1表達相關質粒由廣州艾基生物技術有限公司提供，重組基因質粒、干擾片段引物設計、合成和測序由廣州艾基生物技術完成。

1.2.2 生物信息學分析 從GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/)獲得TCGA中關于LIHC的數(shù)據(jù)，得到肝癌患者例數(shù)為369例，正常對照例數(shù)50例。以|Log2FC| Cutoff=0.56，p-value Cutoff=0.01為臨界參考，分析SRPK1表達在LIHC組織及正常樣本中的差異。分析SRPK1表達在LIHC患者腫瘤分期中的差異性。以肝癌患者腫瘤組織中SRPK1表達的中位數(shù)為Cutoff值，將患者分為高、低表達兩組，用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用 Log-rank 檢驗比較兩組之間的生存差異。運用 TIMER (http://cistrome.org/TIMER/)分析SRPK1表達與LIHC組織中與免疫細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞)浸潤豐度的相關性。采用GSEA預測可能受SRPK1調控的信號機制。

1.2.3 過表達SRPK1的HepG2細胞株構建 轉染前24 h，在500 μL無雙抗完全培養(yǎng)基中接種0.5～2×105個細胞/孔，轉染時細胞融合度為80%～90%。按50 μL Opti-MEM稀釋0.8 μg質粒(pcDNA3.1-HOMO-SRPK1及pcDNA3.1-HOMO-Vector)，50 μL Opti-MEM 稀釋2 μL LipofectamineTM2000，混合溶液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置20 min。轉染復合物制備完成后立即加入到24孔細胞板中，100 μL/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右，換成含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。如此連續(xù)轉染3 d，每天上下午各1次，共6次。轉染結束后(第4天)用0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選細胞，2周后待細胞生長穩(wěn)定、無明顯的死亡細胞時收獲細胞。以轉染pcDNA3.1-HOMO-SRPK1的細胞株為SRPK1組，pcDNA3.1-HOMO-Vector空白轉染細胞為Vector組。

1.2.4 干擾表達SRPK1的HepG2細胞株構建 HOMO-SRPK1-shRNA序列為GAACAACACATTAGCCAACTT。培養(yǎng)皿與先用0.1%明膠鋪底，37℃ 孵箱靜置 30 mim 后，將細胞數(shù)約 3.5×106個的293T細胞鋪于含明膠的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)24 h后轉染。采用PIK 逆轉錄病毒包裝系統(tǒng)。20 μg的pLKO.1-U6-EF1a-copGFP-T2A-puro-SRPK1-shRNA與20 μg包裝質粒PIK混勻分別加入2 M CaCl2、380 μL TE緩沖液，充分混勻后，向管子中繼續(xù)逐滴加入480 μL HEPES緩沖液，將混合液分散滴入培養(yǎng)基中，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后用SA緩沖液輕柔洗滌細胞2次，加入含5%FBS的 DMEM培養(yǎng)基。換液后置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉染2～3 d后，每隔6 h收取一次病毒液，儲存于-80℃冰箱，連續(xù)收取2 d。HepG2細胞鋪板步驟同1.2.3，解凍病毒液，向3 mL病毒液中加入 3 mL 5% FBS DMEM培養(yǎng)基、6 μL 聚凝胺(1∶1000)，混勻，吸掉細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入混好的病毒液3 mL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，接著繼續(xù)加入病毒液繼續(xù)感染細胞，4 h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。連續(xù)感染3 d，每天上、下午各1次，共6次，篩選細胞步驟同1.2.3。以轉染shRNA的細胞株為shRNA組，Scramble空白轉染細胞為Scramble組。

1.2.5 Western blot檢測各組HepG2細胞SRPK1蛋白水平 用蛋白裂解液裂解轉染后的各組細胞，提取總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按30 μg/孔蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉PVDF膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(兔抗人SRPK1)4℃封閉過夜，然后用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加二抗(1∶2000)室溫孵育1 h后，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，用ECL化學發(fā)光試劑曝光。

1.2.6 體外成球實驗 配制干細胞培養(yǎng)基50 mL：50x B27 1 mL、100 μg/μL表皮生長因子 10 μL、100 μg/μL成纖維細胞生長因子 10 μL、10% 牛血清蛋白2 mL、1 mg/mL胰島素 250 uL、DMEM/F12 46.73 mL。SA緩沖液清洗細胞、消化、干細胞培養(yǎng)基垂懸、計數(shù)，以約2×103個/孔劑量接種HepG2細胞于低吸附6孔板，每孔約加總量2mL干細胞培養(yǎng)基，第7天計算細胞SFE(SFE=直徑大于75 μm的細胞球個數(shù)/2000×100%)。

1.2.7 流式細胞術檢測SP細胞比例 用胰蛋白酶消化各組HepG2細胞，在含2%胎牛血清的DMEM中以1×106個細胞/mL重懸，然后在37℃預孵育30 min。加入熒光染料Hoechst33342，終濃度為6 μg/mL；其中空白對照組再加入維拉帕米，終濃度50 μmol/mL。37℃避光水浴90 min，每10 min旋轉一次。置冰上10 min終止染色，計數(shù)細胞；離心后，用4℃含2% 胎牛血清的 PBS洗滌細胞并重懸浮，將分選組調整濃度到1×107/mL以上，用2 μg/mL碘化丙啶來識別死亡細胞，400目紗網(wǎng)過濾細胞。上流式細胞儀對細胞進行分析。Hoechst染料在375nm紫外光激發(fā)，450/40帶通收集藍光，695/40帶通下收集紅光。碘化丙啶在488 nm藍光處激發(fā)，575/26帶通下收集紅光。以Hoechst染料紅光值為X軸，Hoechst染料藍光值為Y軸作二維散點圖，將低Hoechst紅及低Hoechst藍且維拉帕米組缺失的區(qū)域設定為SP細胞的閾值，數(shù)據(jù)采用Summit 5.2軟件進行分析。

1.2.8 實時熒光定量PCR法檢測干性基因mRNA相對表達量 采用TRizol試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，嚴格按試劑盒說明書進行操作。采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR，反應體系共10 μL，包括上游引物(20 μmol/L)0.25 μL，下游引物(20 μmol/L)0.25 μL，2×SYBRGreenmix 5 μL，cDNA 0.2 μL，ddH2O 4.3 μL。混勻后瞬時離心，置PCR儀中反應。引物序列見表1。反應條件：95℃ 60 s；94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 45 s，40個循環(huán)；72℃10 min。4℃保存。以GAPDH為內參，檢測癌細胞干性基因Nanog、Oct4、CD133、Bmi1的mRNA相對表達量，結果以2-△△Ct表示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列表Table 1 Primers sequences of Real-time PCR

2 結果

2.1 SRPK1與LIHC疾病進展及免疫細胞浸潤豐度的關系 根據(jù)從 GEPIA2獲得的數(shù)據(jù)提示，LIHC組織中SRPK1表達明顯升高(P<0.01)，見圖1A。該表達在期癌癥的各個分期中也存在差異(F=3.59，P=0.0139)，見圖1B。高表達SRPK1患者的生存率明顯低于低表達患者(HR=1.5，P=0.024)，見圖1C。在LIHC組織中，SRPK1的表達水平與B細胞(r=0.318,P<0.001)、CD8+T細胞(r=0.159,P=0.003)、CD4+T(r=0.317,P<0.001)、巨噬細胞(r=0.396,P<0.001)、中性粒細胞(r=0.364,P<0.001)和樹突細胞(r=0.338,P<0.001)明顯相關，見圖1D。

2.2 調節(jié)HepG2細胞內SRPK1蛋白表達 經廣州艾基生物技術公司測序驗證，質粒序列與基因庫一致。我們構建了SRPK1過表達的穩(wěn)定株和抑表達穩(wěn)定株，Western Blot結果所示， SRPK1組SRPK1蛋白相對表達量高于Vector組(t=10.81，P<0.01)，shRNA組蛋白相對表達量低于Scramble組(t=10.81，P<0.01)，見圖2。我們所構建的細胞株能夠穩(wěn)定地過表達或者抑表達SRPK1的表達，可用于后續(xù)實驗。

圖2 調節(jié)HepG2細胞SRPK1蛋白表達Figure 2 Regulation of SRPK1 expression in HepG2 cells注：A.重組基因質粒圖譜；B.shRNA干擾基因質粒圖譜；C.重組基因、shRNA測序驗證；D.WB驗證HepG2細胞SRPK1蛋白表達。①P<0.01

2.3 SRPK1對HepG2細胞干性的影響 SRPK1組SFE高于Vector組(t=9.35，P<0.01)，shRNA組低于Scramble組(t=3.01，P=0.04)，見圖3A。SRPK1組SP細胞比例高于Vector組(t=7.72，P<0.01)，shRNA組SP細胞比例低于Scramble組(t=5.22，P<0.01)，見圖3B。體外成球能力和SP細胞比例是腫瘤細胞干性表型的重要體現(xiàn)。結果揭示SRPK1參與HepG2細胞腫瘤干性調節(jié)，過表達SRPK1基因顯著提高了HepG2細胞的干性特征。

圖3 SRPK1對HepG2細胞干性的影響Figure 3 The effect of SRPK1 on tumor stemness in HepG2 cells注：A.各組細胞體外成球能力；B.各組SP細胞比例。①P<0.01，② P<0.05

2.4 SRPK1對HepG2細胞干性相關基因的影響 SRPK1組Nanog、Oct4、CD133、Bmi1 mRNA相對表達量高于Vector組(P<0.05)，Scramble組高于shRNA組(P<0.05)，見圖4。結果表明HepG2細胞的4個干性標志基因受SRPK1表達調節(jié)，其中變化最大的基因為Bmi1。

圖4 SRPK1對HepG2細胞干性基因的影響Figure 4 The effect of SRPK1 on tumor stemness relative genes in HepG2 cells

2.5 SRPK1可能促進HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路活化 目前，有報道稱Wnt/β-catenin通路是誘導CSC表型的積累的關鍵途徑。用GSEA軟件分析了肝癌數(shù)據(jù)庫中SRPK1的表達可能調控的信號機制，結果發(fā)現(xiàn)，SRPK1表達在Wnt/β-catenin通路活化的樣本中高富集(P<0.05)，見圖5。

圖5 SRPK1與Wnt/β-catenin通路的相關性Figure 5 Correlation of SRPK1 and Wnt/β-catenin pathway activation

3 討論

LIHC仍然是目前一個嚴重的世界健康問題，高復發(fā)率是其治療的重大挑戰(zhàn)[7]；新的治療靶點和標志物一直在不停研發(fā)當中[8-9]。目前學界對于促癌基因推動細胞癌變的作用主要集中研究6種能力：CSCs表型的積累，細胞增殖，化療敏感性，逃避程序性死亡，組織侵襲和轉移，以及持續(xù)的血管生成[6]。CSCs是存在于腫瘤組織中的一小部分細胞亞群，具有自我更新以及多向分化潛能等干細胞特性。SP細胞可以有效地作為鑒別肝癌CSCs的標志物，并通過上調干性基因和腫瘤形成來啟動腫瘤發(fā)生，肝癌細胞中SP細胞越多，其轉移能力和腫瘤形成能力越強[10-12]。肝CSCs促進肝細胞癌高侵襲性、耐藥、易復發(fā)、易轉移、預后差等惡性特點[13]，因此，直接靶向肝CSCs被認為是改善LIHC患者預后的一種有效的治療策略[2,14-15]。SRPK1是剪接因子蛋白激酶家族成員之一，是一類保守的真核激酶，能使絲氨酸/精氨酸蛋白磷酸化，刺激mRNA前體的可變剪接加工過程，并通過調控哺乳動物胚胎干細胞的泛素信號通路，確保了神經發(fā)育基因表達的正確調控[16]。調節(jié)SRPK1表達可通過NF-kappaB通路有效改善結腸癌的化療耐藥[17]，以SRPK1作為靶點的方案被證明對白血病治療有效[18]，特異性抑制SRPK1抗癌藥物的開發(fā)已取得一定進展[19]。在既往對SRPK1促瘤能力的研究中發(fā)現(xiàn)，SRPK1可促進肝癌細胞的增殖[20]。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進行分析，結果顯示SRPK1在LIHC組織中表達顯著高于正常組織，高表達SRPK1患者總生存率顯著低于低表達患者。同時，通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SRPK1表達與LIHC組織中多種免疫細胞浸潤正相關。LIHC組織中腫瘤相關免疫細胞通常呈高浸潤狀態(tài),且浸潤水平與多項臨床病理特征和預后密切相關[21]。結果再次證明SRPK1在HCC中與腫瘤發(fā)展及患者的不良預后高度相關[5]。

既往研究報道，SRPK1能促進非小細胞肺癌腫瘤干細胞表型的獲得[4]，也是多種消化系統(tǒng)腫瘤的致癌基因和潛在的治療靶點，但SRPK1對肝癌細胞干性表型的影響目前缺乏報道[6]。為了探討SRPK1對肝癌細胞腫瘤干性的影響，課題組通過前期研究[5]選取中等表達SRPK1的HepG2細胞，構建了不同SRPK1表達的細胞模型。通過一系列體外細胞實驗證明，過表達SRPK1明顯增強HepG2細胞在體外的成球能力，也增加了癌細胞群中SP+細胞的比例，而在抑制SRPK1表達后則觀察到相反的實驗結果。Nanog和Oct4是干細胞自我更新及保持未分化特性的關鍵因子，具有使終端分化細胞重新進入細胞周期進行增殖的能力[22]。CD133高表達可明顯提高腫瘤細胞的成球能力，并誘導癌細胞發(fā)生免疫逃逸和對抗程序性凋亡而獲得更明顯的干細胞表型[23]。Bmi1基因參與肝癌細胞干性功能的維持[24]。我們發(fā)現(xiàn)過表達SRPK1會促使HepG2細胞Nango、Oct4、CD133以及Bmi1的表達增高，而抑制SRPK1表達后，4個腫瘤干性基因表達相應降低。

Wnt/β-catenin通路的過度活化可以直接促進腫瘤的干性獲得、耐藥及免疫逃逸[25]，Gong等[4]對非小細胞肺癌研究指出，Wnt/β-catenin通路是SRPK1誘導CSC表型的積累的關鍵途徑。本次GSEA分析顯示SRPK1高表達與Wnt/β-catenin通路活化呈正相關，預測SRPK1在體外促進HepG2細胞干性的獲得可能與Wnt/β-catenin通路的活化有關。

綜上所述，SRPK1在體外可促進HepG2細胞腫瘤干性的獲得，結論與SRPK1對其他類型腫瘤(肺癌、前列腺癌、結腸癌等)的作用一致，機制可能與Wnt/β-catenin通路活化有關，研究結果為以SRPK1作為肝細胞肝癌的治療靶點提供了新的理論依據(jù)。但本研究具有一定局限性，首先流式細胞實驗結果顯示HepG2細胞自身SP亞群所占比例較低，因此以SRPK1為治療靶點抑制干性作為LIHC的治療方向仍然待進一步論證，我們計劃在往后研究中以SP亞群比例更高的細胞進行實驗，并結合裸鼠體內成瘤實驗進行驗證，增加本研究結論的說服力。其次，本次研究未通過相關實驗確證Wnt/β-catenin通路在SRPK1促進HepG2細胞干性獲得過程中的作用，我們下一步將針對該通路的作用靶點進行更具體的分子機制分析。

4 結論

SRPK1與LIHC發(fā)展緊密聯(lián)系，其高表達既預示腫瘤的不良預后，也促進肝癌細胞干性表型的獲得，機制可能通過與Wnt/β-catenin通路激活相關。