絲氨酸精氨酸蛋白激酶1在體外促進HepG2細胞干性的獲得*

肖綺雯 石永杰 周強 黃思聰 康嘉樂 嘉紅云 彭永正

(1. 南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，廣東 廣州 510280；2.廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科，廣東 廣州 510260；3.南方醫科大學珠江醫院輸血科，廣東 廣州 510280)

根據GLOBOCAN 2020數據，全球原發性肝癌年新發病數達905,677人，年新增死亡病例830,180人，在全球發病率中排名第五，在男性死亡率中排名第二；肝細胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)是原發性肝癌的主要類型[1]。LIHC患者預后差的主要原因是復發率高，且腫瘤干細胞(Cancer stem cells, CSCs)的存在被認為是肝癌復發的根本原因[2]。絲氨酸精氨酸蛋白激酶1(Serine arginine protein kinase 1，SRPK1)是一種mRNA前體的剪接因子，在睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤中高表達，并促進結腸癌、卵巢癌細胞的藥物抗性[3]，在非小細胞肺癌中能促進CSCs表型的積累[4]。此前，我們發現高表達SRPK1與肝細胞癌發展相關[5]，但其機制尚未完全闡明[6]。本研究中，我們進一步通過調控SRPK1在肝癌細胞株HepG2細胞的表達，研究SRPK1對HepG2細胞腫瘤干性影響，為以SRPK1為靶點的肝細胞癌治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料 HepG2細胞于廣州醫科大學附屬第二醫院中心實驗室凍存，常規方法復蘇凍存細胞，采用體積分數5%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 mg/L青霉素的DMEM培養液，置于37℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中常規培養。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、嘌呤霉素(美國Gibco公司)，表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素(美國PeproTech公司)，TBST緩沖液(美國Thermo Fisher公司)，ABI7500 Fast實時熒光定量PCR儀(美國applied biosystems公司)，Epics ALTRA流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，桌上離心機(德國sigma公司)。B27、DMEM/F12培養基、總RNA抽提試劑Trizol、Optim-MEM培養基、轉染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix(加拿大Fermentas公司)。兔抗人SRPK1(美國Abcam公司)，兔抗人GAPDH(美國Proteintech公司)，HRP-鼠二抗/HRP-兔二抗(美國Merck公司)。牛血清蛋白、熒光染料Hoechst33342、維拉帕米、碘化丙啶(美國Sigma-Aldrich公司)。調節SRPK1表達相關質粒由廣州艾基生物技術有限公司提供，重組基因質粒、干擾片段引物設計、合成和測序由廣州艾基生物技術完成。

1.2.2 生物信息學分析 從GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/)獲得TCGA中關于LIHC的數據，得到肝癌患者例數為369例，正常對照例數50例。以|Log2FC| Cutoff=0.56，p-value Cutoff=0.01為臨界參考，分析SRPK1表達在LIHC組織及正常樣本中的差異。分析SRPK1表達在LIHC患者腫瘤分期中的差異性。以肝癌患者腫瘤組織中SRPK1表達的中位數為Cutoff值，將患者分為高、低表達兩組，用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用 Log-rank 檢驗比較兩組之間的生存差異。運用 TIMER (http://cistrome.org/TIMER/)分析SRPK1表達與LIHC組織中與免疫細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞)浸潤豐度的相關性。采用GSEA預測可能受SRPK1調控的信號機制。

1.2.3 過表達SRPK1的HepG2細胞株構建 轉染前24 h，在500 μL無雙抗完全培養基中接種0.5～2×105個細胞/孔，轉染時細胞融合度為80%～90%。按50 μL Opti-MEM稀釋0.8 μg質粒(pcDNA3.1-HOMO-SRPK1及pcDNA3.1-HOMO-Vector)，50 μL Opti-MEM 稀釋2 μL LipofectamineTM2000，混合溶液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置20 min。轉染復合物制備完成后立即加入到24孔細胞板中，100 μL/孔，37℃、5% CO2培養箱中培養6 h左右，換成含5%胎牛血清的培養基，37℃，5%CO2繼續培養。如此連續轉染3 d，每天上下午各1次，共6次。轉染結束后(第4天)用0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選細胞，2周后待細胞生長穩定、無明顯的死亡細胞時收獲細胞。以轉染pcDNA3.1-HOMO-SRPK1的細胞株為SRPK1組，pcDNA3.1-HOMO-Vector空白轉染細胞為Vector組。

1.2.4 干擾表達SRPK1的HepG2細胞株構建 HOMO-SRPK1-shRNA序列為GAACAACACATTAGCCAACTT。培養皿與先用0.1%明膠鋪底，37℃ 孵箱靜置 30 mim 后，將細胞數約 3.5×106個的293T細胞鋪于含明膠的培養皿上培養24 h后轉染。采用PIK 逆轉錄病毒包裝系統。20 μg的pLKO.1-U6-EF1a-copGFP-T2A-puro-SRPK1-shRNA與20 μg包裝質粒PIK混勻分別加入2 M CaCl2、380 μL TE緩沖液，充分混勻后，向管子中繼續逐滴加入480 μL HEPES緩沖液，將混合液分散滴入培養基中，置于細胞培養箱培養。6 h后用SA緩沖液輕柔洗滌細胞2次，加入含5%FBS的 DMEM培養基。換液后置于細胞培養箱繼續培養。轉染2～3 d后，每隔6 h收取一次病毒液，儲存于-80℃冰箱，連續收取2 d。HepG2細胞鋪板步驟同1.2.3，解凍病毒液，向3 mL病毒液中加入 3 mL 5% FBS DMEM培養基、6 μL 聚凝胺(1∶1000)，混勻，吸掉細胞培養皿中的培養基，加入混好的病毒液3 mL繼續培養4 h，換正常培養基培養2 h，接著繼續加入病毒液繼續感染細胞，4 h后換正常培養基培養過夜。連續感染3 d，每天上、下午各1次，共6次，篩選細胞步驟同1.2.3。以轉染shRNA的細胞株為shRNA組，Scramble空白轉染細胞為Scramble組。

1.2.5 Western blot檢測各組HepG2細胞SRPK1蛋白水平 用蛋白裂解液裂解轉染后的各組細胞，提取總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按30 μg/孔蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉PVDF膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(兔抗人SRPK1)4℃封閉過夜，然后用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加二抗(1∶2000)室溫孵育1 h后，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，用ECL化學發光試劑曝光。

1.2.6 體外成球實驗 配制干細胞培養基50 mL：50x B27 1 mL、100 μg/μL表皮生長因子 10 μL、100 μg/μL成纖維細胞生長因子 10 μL、10% 牛血清蛋白2 mL、1 mg/mL胰島素 250 uL、DMEM/F12 46.73 mL。SA緩沖液清洗細胞、消化、干細胞培養基垂懸、計數，以約2×103個/孔劑量接種HepG2細胞于低吸附6孔板，每孔約加總量2mL干細胞培養基，第7天計算細胞SFE(SFE=直徑大于75 μm的細胞球個數/2000×100%)。

1.2.7 流式細胞術檢測SP細胞比例 用胰蛋白酶消化各組HepG2細胞，在含2%胎牛血清的DMEM中以1×106個細胞/mL重懸，然后在37℃預孵育30 min。加入熒光染料Hoechst33342，終濃度為6 μg/mL；其中空白對照組再加入維拉帕米，終濃度50 μmol/mL。37℃避光水浴90 min，每10 min旋轉一次。置冰上10 min終止染色，計數細胞；離心后，用4℃含2% 胎牛血清的 PBS洗滌細胞并重懸浮，將分選組調整濃度到1×107/mL以上，用2 μg/mL碘化丙啶來識別死亡細胞，400目紗網過濾細胞。上流式細胞儀對細胞進行分析。Hoechst染料在375nm紫外光激發，450/40帶通收集藍光，695/40帶通下收集紅光。碘化丙啶在488 nm藍光處激發，575/26帶通下收集紅光。以Hoechst染料紅光值為X軸，Hoechst染料藍光值為Y軸作二維散點圖，將低Hoechst紅及低Hoechst藍且維拉帕米組缺失的區域設定為SP細胞的閾值，數據采用Summit 5.2軟件進行分析。

1.2.8 實時熒光定量PCR法檢測干性基因mRNA相對表達量 采用TRizol試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，嚴格按試劑盒說明書進行操作。采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR，反應體系共10 μL，包括上游引物(20 μmol/L)0.25 μL，下游引物(20 μmol/L)0.25 μL，2×SYBRGreenmix 5 μL，cDNA 0.2 μL，ddH2O 4.3 μL。混勻后瞬時離心，置PCR儀中反應。引物序列見表1。反應條件：95℃ 60 s；94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 45 s，40個循環；72℃10 min。4℃保存。以GAPDH為內參，檢測癌細胞干性基因Nanog、Oct4、CD133、Bmi1的mRNA相對表達量，結果以2-△△Ct表示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列表Table 1 Primers sequences of Real-time PCR

2 結果

2.1 SRPK1與LIHC疾病進展及免疫細胞浸潤豐度的關系 根據從 GEPIA2獲得的數據提示，LIHC組織中SRPK1表達明顯升高(P<0.01)，見圖1A。該表達在期癌癥的各個分期中也存在差異(F=3.59，P=0.0139)，見圖1B。高表達SRPK1患者的生存率明顯低于低表達患者(HR=1.5，P=0.024)，見圖1C。在LIHC組織中，SRPK1的表達水平與B細胞(r=0.318,P<0.001)、CD8+T細胞(r=0.159,P=0.003)、CD4+T(r=0.317,P<0.001)、巨噬細胞(r=0.396,P<0.001)、中性粒細胞(r=0.364,P<0.001)和樹突細胞(r=0.338,P<0.001)明顯相關，見圖1D。

2.2 調節HepG2細胞內SRPK1蛋白表達 經廣州艾基生物技術公司測序驗證，質粒序列與基因庫一致。我們構建了SRPK1過表達的穩定株和抑表達穩定株，Western Blot結果所示， SRPK1組SRPK1蛋白相對表達量高于Vector組(t=10.81，P<0.01)，shRNA組蛋白相對表達量低于Scramble組(t=10.81，P<0.01)，見圖2。我們所構建的細胞株能夠穩定地過表達或者抑表達SRPK1的表達，可用于后續實驗。

圖2 調節HepG2細胞SRPK1蛋白表達Figure 2 Regulation of SRPK1 expression in HepG2 cells注：A.重組基因質粒圖譜；B.shRNA干擾基因質粒圖譜；C.重組基因、shRNA測序驗證；D.WB驗證HepG2細胞SRPK1蛋白表達。①P<0.01

2.3 SRPK1對HepG2細胞干性的影響 SRPK1組SFE高于Vector組(t=9.35，P<0.01)，shRNA組低于Scramble組(t=3.01，P=0.04)，見圖3A。SRPK1組SP細胞比例高于Vector組(t=7.72，P<0.01)，shRNA組SP細胞比例低于Scramble組(t=5.22，P<0.01)，見圖3B。體外成球能力和SP細胞比例是腫瘤細胞干性表型的重要體現。結果揭示SRPK1參與HepG2細胞腫瘤干性調節，過表達SRPK1基因顯著提高了HepG2細胞的干性特征。

圖3 SRPK1對HepG2細胞干性的影響Figure 3 The effect of SRPK1 on tumor stemness in HepG2 cells注：A.各組細胞體外成球能力；B.各組SP細胞比例。①P<0.01，② P<0.05

2.4 SRPK1對HepG2細胞干性相關基因的影響 SRPK1組Nanog、Oct4、CD133、Bmi1 mRNA相對表達量高于Vector組(P<0.05)，Scramble組高于shRNA組(P<0.05)，見圖4。結果表明HepG2細胞的4個干性標志基因受SRPK1表達調節，其中變化最大的基因為Bmi1。

圖4 SRPK1對HepG2細胞干性基因的影響Figure 4 The effect of SRPK1 on tumor stemness relative genes in HepG2 cells

2.5 SRPK1可能促進HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路活化 目前，有報道稱Wnt/β-catenin通路是誘導CSC表型的積累的關鍵途徑。用GSEA軟件分析了肝癌數據庫中SRPK1的表達可能調控的信號機制，結果發現，SRPK1表達在Wnt/β-catenin通路活化的樣本中高富集(P<0.05)，見圖5。

圖5 SRPK1與Wnt/β-catenin通路的相關性Figure 5 Correlation of SRPK1 and Wnt/β-catenin pathway activation

3 討論

LIHC仍然是目前一個嚴重的世界健康問題，高復發率是其治療的重大挑戰[7]；新的治療靶點和標志物一直在不停研發當中[8-9]。目前學界對于促癌基因推動細胞癌變的作用主要集中研究6種能力：CSCs表型的積累，細胞增殖，化療敏感性，逃避程序性死亡，組織侵襲和轉移，以及持續的血管生成[6]。CSCs是存在于腫瘤組織中的一小部分細胞亞群，具有自我更新以及多向分化潛能等干細胞特性。SP細胞可以有效地作為鑒別肝癌CSCs的標志物，并通過上調干性基因和腫瘤形成來啟動腫瘤發生，肝癌細胞中SP細胞越多，其轉移能力和腫瘤形成能力越強[10-12]。肝CSCs促進肝細胞癌高侵襲性、耐藥、易復發、易轉移、預后差等惡性特點[13]，因此，直接靶向肝CSCs被認為是改善LIHC患者預后的一種有效的治療策略[2,14-15]。SRPK1是剪接因子蛋白激酶家族成員之一，是一類保守的真核激酶，能使絲氨酸/精氨酸蛋白磷酸化，刺激mRNA前體的可變剪接加工過程，并通過調控哺乳動物胚胎干細胞的泛素信號通路，確保了神經發育基因表達的正確調控[16]。調節SRPK1表達可通過NF-kappaB通路有效改善結腸癌的化療耐藥[17]，以SRPK1作為靶點的方案被證明對白血病治療有效[18]，特異性抑制SRPK1抗癌藥物的開發已取得一定進展[19]。在既往對SRPK1促瘤能力的研究中發現，SRPK1可促進肝癌細胞的增殖[20]。本研究通過對TCGA數據庫進行分析，結果顯示SRPK1在LIHC組織中表達顯著高于正常組織，高表達SRPK1患者總生存率顯著低于低表達患者。同時，通過TIMER數據庫分析發現SRPK1表達與LIHC組織中多種免疫細胞浸潤正相關。LIHC組織中腫瘤相關免疫細胞通常呈高浸潤狀態,且浸潤水平與多項臨床病理特征和預后密切相關[21]。結果再次證明SRPK1在HCC中與腫瘤發展及患者的不良預后高度相關[5]。

既往研究報道，SRPK1能促進非小細胞肺癌腫瘤干細胞表型的獲得[4]，也是多種消化系統腫瘤的致癌基因和潛在的治療靶點，但SRPK1對肝癌細胞干性表型的影響目前缺乏報道[6]。為了探討SRPK1對肝癌細胞腫瘤干性的影響，課題組通過前期研究[5]選取中等表達SRPK1的HepG2細胞，構建了不同SRPK1表達的細胞模型。通過一系列體外細胞實驗證明，過表達SRPK1明顯增強HepG2細胞在體外的成球能力，也增加了癌細胞群中SP+細胞的比例，而在抑制SRPK1表達后則觀察到相反的實驗結果。Nanog和Oct4是干細胞自我更新及保持未分化特性的關鍵因子，具有使終端分化細胞重新進入細胞周期進行增殖的能力[22]。CD133高表達可明顯提高腫瘤細胞的成球能力，并誘導癌細胞發生免疫逃逸和對抗程序性凋亡而獲得更明顯的干細胞表型[23]。Bmi1基因參與肝癌細胞干性功能的維持[24]。我們發現過表達SRPK1會促使HepG2細胞Nango、Oct4、CD133以及Bmi1的表達增高，而抑制SRPK1表達后，4個腫瘤干性基因表達相應降低。

Wnt/β-catenin通路的過度活化可以直接促進腫瘤的干性獲得、耐藥及免疫逃逸[25]，Gong等[4]對非小細胞肺癌研究指出，Wnt/β-catenin通路是SRPK1誘導CSC表型的積累的關鍵途徑。本次GSEA分析顯示SRPK1高表達與Wnt/β-catenin通路活化呈正相關，預測SRPK1在體外促進HepG2細胞干性的獲得可能與Wnt/β-catenin通路的活化有關。

綜上所述，SRPK1在體外可促進HepG2細胞腫瘤干性的獲得，結論與SRPK1對其他類型腫瘤(肺癌、前列腺癌、結腸癌等)的作用一致，機制可能與Wnt/β-catenin通路活化有關，研究結果為以SRPK1作為肝細胞肝癌的治療靶點提供了新的理論依據。但本研究具有一定局限性，首先流式細胞實驗結果顯示HepG2細胞自身SP亞群所占比例較低，因此以SRPK1為治療靶點抑制干性作為LIHC的治療方向仍然待進一步論證，我們計劃在往后研究中以SP亞群比例更高的細胞進行實驗，并結合裸鼠體內成瘤實驗進行驗證，增加本研究結論的說服力。其次，本次研究未通過相關實驗確證Wnt/β-catenin通路在SRPK1促進HepG2細胞干性獲得過程中的作用，我們下一步將針對該通路的作用靶點進行更具體的分子機制分析。

4 結論

SRPK1與LIHC發展緊密聯系，其高表達既預示腫瘤的不良預后，也促進肝癌細胞干性表型的獲得，機制可能通過與Wnt/β-catenin通路激活相關。