張帆 湯禮軍 黃竹 吳俊，3 黃尚卿

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2.西部戰區總醫院全軍普通外科中心，四川 成都 610083;3.西南交通大學醫學院，四川 成都 610031)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是以胰腺的廣泛炎癥反應伴組織壞死為主要特征的病變，病情發展迅速，當疾病進展為多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)時，死亡率較高[1]。腸道是重癥急性胰腺炎胰腺外并發癥最常見的器官之一，SAP所繼發的腸道炎性介質的過度釋放、缺血-再灌注及一氧化氮損傷、氧化應激反應和腸上皮細胞凋亡在腸道損傷中起到了重要作用，也與SAP的嚴重程度和愈后密切相關[2-5]。因此，減輕腸道損傷成為治療SAP時胰腺外并發癥中尤為重要的一步。 在膽道梗阻性胰腺炎中，血清總膽汁酸濃度會明顯上升[6]，排入腸道的膽汁酸量會明顯減少,并且血清循環總膽汁酸的水平與急性胰腺炎患者的多器官功能衰竭密切相關[7-8]。而在非膽道梗阻性胰腺炎中，已經證實?；切苋パ跄懰?Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)能顯著減輕急性胰腺炎中內質網的應激反應以及腺泡細胞的損傷[9-10]，并且通過腸道細菌的代謝作用減輕胰腺炎的腸道損傷[11]。那么，與TUDCA同為治療膽固醇性結石，且已經證實在多種疾病的腸道損傷具有保護作用的鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)是否也具有類似于TUDCA的胰腺炎中胰腺和腸道保護的功能，值得研究。基于此，本研究探討補充外源性膽汁酸CDCA對急性重癥胰腺炎大鼠胰腺及腸道損傷的影響和意義，以期為SAP早期胰外并發癥的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD健康雄性大鼠(6～8周齡)45只購自成都達碩實驗動物有限公司，體重200～300 g, 隨機分為Sham組(n=15)、SAP組(n=15)、CDCA組(n=15)。實驗前，先進行一周的適應性喂養，室溫和濕度適宜，交替光照和黑暗各12 h。 本實驗所有檢測方法和動物實驗程序均經過中國人民解放軍西部戰區總醫院動物倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器 ?；悄懰徕c(中國索萊寶)用生理鹽水配制成5%濃度，水合氯醛(成都艾澤威生物科技有限公司)用生理鹽水配制成5%濃度，鵝去氧膽酸(浙江英沃迪生物科技有限公司)配制成含0.5%CDCA的特殊飼料，淀粉酶、脂肪酶、二胺氧化酶(Diamine Oxidase，DAO)、腸型脂肪酸結合蛋白(Intestinal Fatty Acid-Binding Protein，IFABP)、D-乳酸(D-lactic acid)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)檢測的ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，TGR5抗體購自愛必信生物科技有限公司，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)購自Affinity公司。

1.3 模型制備 SAP組：SD大鼠術前禁食、自由飲水12 h，隨后腹腔注射5%的水合氯醛0.7 mL/100 g進行麻醉。麻醉后，大鼠固定于操作臺，作一長約5 cm的上腹部正中切口，上至劍突，隨后鋪無菌手術單并暴露腹腔，找到十二指腸降部，向左翻轉，暴露腸系膜右側面，定位膽胰管近十二指腸開口處，隨后用小動脈夾夾閉肝門處的膽總管，使用4號針頭逆行穿刺，成功后使用1 mL注射器緩慢推注5%?；悄懰徕c1 min，推注用量為0.1 mL/100 g，推注完成后依次去掉小動脈夾和4號針頭，停留觀察5 min后關腹，然后置于室溫23～25℃的復蘇室待醒。CDCA組：先喂養含0.5% CDCA的飼料一周，隨后造SAP模。Sham組：喂養方法同SAP組，麻醉開腹僅撥動十二指腸降部后關腹。造模成功后24 h取標本，小腸取回腸末端近盲腸處4～5 cm，血液通過腹主動脈采集。

1.4 小腸和胰腺組織病理學檢測 經4%多聚甲醛溶液固定24 h，嚴格按照病理實驗檢測的程序進行修剪、梯度脫水、包埋、切片、HE染色、封片，最后鏡檢合格的樣片。胰腺組織病理評分參照Kusske評分方法[12]，小腸組織病理評分參照Chiu′s評分方法[13]。

1.5 酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清淀粉酶、脂肪酶、炎性因子、腸道損傷相關指標 血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、IFABP、D-Lac、IL-1β、IL-6 、IL-18、TNF-α水平均采用 ELISA 法測定。實驗方法以訂購的試劑盒說明書為標準，經過包被、封閉、洗滌、加樣、溫育、加酶結合物、加顯色底物等標準步驟進行檢測。

1.6 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法檢測腸黏膜上皮細胞凋亡情況 小腸組織采用TUNEL 法檢測腸上皮細胞的凋亡情況，經過脫蠟、水化、浸洗、固定、反應、DAB顯色等標準實驗步驟后，使用熒光顯微鏡觀察，計算凋亡指數。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小腸組織TGR5以及NLRP3的蛋白表達情況 小腸組織采用Western blot檢測TGR5以及NLRP3的蛋白表達情況，按照小腸組織總蛋白提取、蛋白濃度測定、變性、SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、免疫反應、化學發光、圖像采集等步驟，最后計算TGR5以及NLRP3蛋白在各組小腸組織的相對表達量。

2 結果

2.1 CDCA對大鼠胰腺組織病理損傷觀察結果比較 HE染色后在光鏡下觀察到Sham 組大鼠的胰腺組織大體結構正常，SAP組大鼠的胰腺組織可見小葉間明顯水腫，腺泡間隔變大，腺泡細胞排列紊亂、萎縮，同時呈現溶解性壞死(黑色箭頭)，呈嗜酸性的無結構纖維狀，并可見大量炎性細胞浸潤(黃色箭頭)，間質可見明顯出血(綠色箭頭)。與 SAP 組比較，CDCA組胰腺組織病理損傷顯著減輕，主要表現為胰腺組織鏡下大體結構清晰，但仍可見小葉間水腫，少量的腺泡細胞壞死(黑色箭頭)及少量的炎性細胞彌散性浸潤(黃色箭頭)，見圖1。

圖1 CDCA對大鼠胰腺組織病理損傷觀察結果以及病理評分比較Figure 1 Observation on histopathological damage of rat pancreas by CDCA and comparison of pathological scores注：A.Sham組、SAP組以及CDCA組大鼠胰腺組織HE染色(標尺=100 μm)；B.各組大鼠胰腺組織病理評分。與Sham組相比，①P<0.05；與SAP組相比，②P<0.05

2.2 CDCA對大鼠胰腺炎的血清指標影響的比較 SAP組大鼠的胰腺炎血清指標淀粉酶、脂肪酶的水平較Sham組有明顯升高(P<0.05)，經CDCA干預后均有明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠胰腺炎相關指標血清淀粉酶、血清脂肪酶水平比較Table 1 Comparison of serum amylase and serum lipase levels in rats of each group

2.3 CDCA對大鼠血清全身炎癥指標影響的比較 與Sham組相比，SAP組大鼠血清全身炎性因子IL-1β、IL-6、IL-18 以及TNF-α水平均有明顯升高(P<0.05)；而經過CDCA干預后，大鼠的全身炎癥指標均有明顯下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表達水平比較Table 2 Comparison of serum IL-1β, IL-6, IL-18 and TNF-α expression levels in rats of each group

2.4 CDCA對大鼠腸道組織病理損傷觀察結果的比較 HE染色結果顯示，Sham組大鼠小腸組織結構正常，SAP 組大鼠的小腸結構明顯破壞，小腸絨毛形態明顯異常，大量的腸絨毛上皮細胞脫落(綠色箭頭)，部分組織的腸絨毛相互融合、斷裂、脫落(藍色箭頭)，伴有大量炎性細胞浸潤(黃色箭頭)，同時可見固有層裸露，毛細血管充血、擴張；而經過CDCA干預后大鼠的小腸病理損傷有明顯緩解，但仍可見少量的上皮細胞脫落(綠色箭頭)及炎性細胞浸潤(黃色箭頭)，見圖2。

圖2 CDCA對大鼠小腸組織病理損傷觀察結果比較Figure 2 Comparison on the results of histopathological damage observed in the small intestine of rats by CDCA注：A.Sham組、SAP組以及CDCA組大鼠小腸組織HE染色(標尺=100 μm)；B.各組大鼠小腸組織病理評分。與Sham組相比，①P<0.05；與SAP組相比，②P<0.05

2.5 CDCA對大鼠腸道組織的腸道損傷標志物影響的比較 與Sham組相比，SAP 組大鼠的腸道組織損傷的特異性標志物DAO、IFABP以及D-Lac水平較sham組有明顯升高(P<0.05)，經CDCA干預后均下降(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腸道損傷標志物血清DAO水平、IFABP、D-Lac水平表達比較Table 3 Comparison on expression of serum DAO, IFABP and D-Lac levels in rats in each group

2.6 CDCA對小腸黏膜上皮細胞凋亡影響的觀察結果及凋亡率的比較 TUNEL法檢測小腸黏膜上皮細胞凋亡的結果顯示，SAP組大鼠的小腸黏膜細胞凋亡指數及凋亡率較Sham組明顯升高(P<0.05)；經過CDCA干預后，小腸黏膜細胞凋亡指數及凋亡率較SAP組有明顯下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 CDCA對小腸黏膜上皮細胞凋亡影響的觀察結果及凋亡率的比較 Figure 3 Observations on the effect of CDCA to the apoptosis of small intestinal mucosal epithelial cells and comparison of the apoptosis rate注：A.TUNEL 法檢測小腸黏膜上皮細胞的凋亡；B.各組大鼠小腸黏膜上皮細胞凋亡率的比較。與Sham組比較，①P<0.05；與SAP組比較，②P<0.05

2.7 CDCA對小腸組織TGR5以及NLRP3蛋白表達的影響 Western blot檢測小腸組織的TGR5及NLRP3蛋白表達結果顯示，SAP造模后大鼠的小腸組織中TGR5蛋白的表達較Sham組明顯增多(P<0.05)；同時，小腸組織的NLRP3在進行SAP造模后也明顯增多，而在進行CDCA干預后表達明顯下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 CDCA對小腸組織TGR5蛋白以及NLRP3表達影響的比較Figure 4 Comparison of the effects of CDCA on the expression of TGR5 protein and NLRP3 in small intestine tissues注：TGR5以及NLRP3蛋白表達；B.各組大鼠小腸組織TGR5及NLRP3蛋白相對表達量。與 Sham組比較，①P<0.05；與 SAP 組比較，②P<0.05

3 討論

研究證實，腸道是人體內最大的免疫器官，SAP并發胰外損傷時首當其沖；在發生SAP時，腸黏膜屏障以及腸道免疫功能受損，導致腸內細菌穿過受損的黏膜進入腸外器官和血液循環，從而繼發SIRS和MODS[14]。因此，阻止腸道這一“扳機點”部位的損傷，不僅可以減輕SAP的嚴重程度, 還能改善疾病的預后，降低死亡率，使此研究具有了現實的臨床意義。

膽汁酸作為膽汁的主要成分，不僅可以促進脂肪和脂溶性維生素的吸收[15],還能與膽汁酸受體相互作用來調節自身代謝和腸道功能穩態[16]。在以往的研究中，主要聚焦于膽汁酸在肝膽疾病中的作用，直到最近幾年才將其影響逐步擴展到肝膽以外：主要包括在腸道缺血再灌注損傷中的保護作用[17]，對腸道干細胞的激活、促進腸上皮細胞再生的作用[18]，對腸道免疫細胞群組成的調節[19]以及癌癥預防和治療的新方向等[20-21]。CDCA作為膽汁酸中的一種，口服后在腸道內變成石膽酸(Lithocholic acid，LCA)， LCA又能在腸道內代謝為3-oxoLCA 和 isoalloLCA，隨后被修飾成特定的免疫調節分子，進而在腸道發揮促炎或抗炎的免疫調節作用[22]。因此，本實驗探究了CDCA在SAP大鼠的胰腺及腸道中是否也具有類似的效果。本研究結果表明，經過CDCA干預后再進行SAP造模的大鼠胰腺組織病理損傷較Sham組有明顯的減輕，病理評分也顯著下降；同時，血清淀粉酶、脂肪酶以及全身炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α)的表達水平也明顯降低，使大鼠的全身炎癥反應得到了有效的控制。研究顯示[23]，在進行急性胰腺炎造模后，胰腺中膽汁酸受體TGR5的表達水平會明顯升高，作為保護性因素，被特異性激動劑激活后，通過抑制活性氧等途徑來減輕胰腺損傷及全身炎癥反應。 因此，探明CDCA在SAP腸道損傷中的作用，有助于為臨床治療SAP的胰腺外并發癥提供新的思路。

腸道損傷的轉歸也是影響SAP進展和預后的重要因素，腸道的損傷不僅能刺激機體進一步產生炎性因子，腸黏膜屏障的破壞還能導致細菌入血造成全身感染而進一步加重SAP。因此，接下來我們研究了CDCA對腸道本身的影響。本研究發現，CDCA干預后可以顯著減輕腸道損傷的嚴重程度，表現為小腸的病理評分以及腸道上皮細胞的凋亡率顯著降低；同時，腸道損傷的特異性血清標志物DAO、IFABP和D-Lac的水平較SAP組也有明顯下降。對于CDCA減輕腸道損傷的作用機制，在其他疾病模型中已有研究，主要是通過激活腸道膽汁酸受體——法尼酯X受體(farnesoid X receptor，FXR)來發揮作用。肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase，MLCK)是一種能夠影響腸道連接蛋白表達，進而改變腸黏膜屏障通透性和完整性的蛋白激酶。Song等[24]研究發現 CDCA可以通過FXR-MLCK途徑在脂多糖誘導的大鼠腸上皮損傷中發揮保護作用；同時，在腸道的缺血再灌注損傷中，CDCA也能通過促進腸道連接蛋白的表達，維持腸黏膜屏障的完整，以發揮保護腸道的作用[17]。但是，同為膽汁酸受體的TGR5在腸道中的影響目前報道鮮少，前文已述，TGR5受體的激活對于胰腺具有一定保護作用，對于全身炎癥反應也有一定的抑制作用[25]；而在腸道組織中也廣泛表達的TGR5受體是否在CDCA的激活下發揮其作用，值得探究。因此本研究中我們推測膽汁酸CDCA減輕SAP大鼠胰腺和腸道損傷的作用機制,可能與激活腸道特異性的膽汁酸受體TGR5有關。

TGR5受體作為G蛋白偶聯受體家族(G protein-coupled receptors，GPCRs)中的一種，在人類的多種組織器官如胰腺、腸道中廣泛表達[26]。本研究用Western blot試驗證實了小腸組織的TGR5受體在進行SAP造模后表達會明顯升高；而CDCA作為TGR5受體的強激動劑，在激活TGR5受體后可以通過TGR5-cAMP-PKA軸來抑制NLRP3的表達[27]。NLRP3是多種蛋白質組成的復合物，其表達增高提示炎性小體的激活增多，能夠調節胱冬肽酶-1的活化，促使前體IL-1β和前體IL-18的成熟及分泌。IL-1β是早期炎癥擴散和無菌性炎癥的重要細胞因子，而IL-18也在機體內發揮促炎效果，兩者的分泌增多會導致炎細胞浸潤，進一步加重組織的損傷[28]；另外，NLRP3還介導了急性胰腺炎中胰腺的炎癥和損害[29]。在本文中，由于SAP造模后血清炎癥因子IL- 1β和IL-18分泌增多，因此我們將目光聚焦于NLRP3炎性小體上，通過Western blot實驗表明NLRP3在SAP大鼠的小腸組織中表達升高，而在CDCA干預后的小腸組織中NLRP3的表達降低。以上結果提示了膽汁酸受體TGR5和NLRP3炎性小體參與了SAP大鼠中胰腺及腸道損傷的過程。推測SAP造模后，TGR5受體作為保護性因素在腸道組織中的表達升高，經過CDCA干預后TGR5受體激活，通過抑制腸道NLRP3的表達，從而抑制了全身的炎癥反應，減輕了胰腺及腸道的損傷。

4 結論

膽汁酸CDCA可能通過激活SAP大鼠腸道組織的TGR5蛋白，從而抑制NLRP3的表達及炎性小體的激活，減輕大鼠全身的炎性反應，緩解胰腺和小腸損傷的嚴重程度，在SAP中發揮了一定的保護作用。本研究為SAP早期胰外并發癥的治療提供了新的方向，但具體的作用機制還需要更深一步的研究證實。