胃癌組織miR-513a-3p、RNF6表達及其與患者預后的關系

李紅云，徐 陽

中國人民解放軍總醫院第三醫學中心腫瘤內科，北京 100039

胃癌是一種源于胃黏膜上皮的腫瘤，其發病率高，早期無明顯癥狀，使其早期診斷率低，預后較差[1-2]。因此，探尋可早期診治胃癌的有效指標甚是重要。研究認為，胃癌發生發展與微小RNA(microRNA，miRNA)異常表達、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染、相關信號轉導等有關[3-4]。有關研究顯示，miR-513a-3p在胃癌細胞中呈低表達，其可能是胃癌的診治靶點[5]；另外，環指蛋白6(ring finger protein 6，RNF6)在胃癌患者中表達水平較高，其與胃癌發生發展關系密切[6]。但miR-513a-3p在胃癌組織中的表達水平及其與RNF6、預后的關系鮮有報道。因此，本文通過測定miR-513a-3p、RNF6在胃癌組織中的表達情況，分析miR-513a-3p與RNF6的相關性，及二者與胃癌患者預后的關系，以期為臨床診治胃癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2015年12月至2018年5月我院收治的胃癌患者77例作為研究對象，年齡(59.74±14.38)歲(39～76歲)，<60歲33例，≥60歲44例；淋巴結轉移31例，淋巴結未轉移46例；H.pylori感染49例，H.pylori未感染28例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期32例；男46例，女31例；低分化30例，中、高分化47例；腫瘤直徑≤ 5 cm 35例，> 5 cm 42例。

納入標準：(1)患者符合《NCCN胃癌臨床實踐指南》[7]中有關胃癌判定標準，經組織病理檢查確診；(2)患者為初診，有完善的檢查資料；(3)患者對本研究知情同意，獲得了本院倫理委員會批準(批號：2015-04-72)。排除標準：(1)病理檢查難以確定者；(2)合并肝、腎、心器官功能不全、其他腫瘤者；(3)術前接受抗腫瘤治療者。

1.2 方法

1.2.1 Ualcan數據庫檢索：利用Ualcan數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)檢索RNF6 mRNA表達水平。gene symbol設為RNF6，TCGA數據集設定為Stomach adenocacinoma，進行檢索。

1.2.2 組織標本收集：收集胃癌患者經手術切除的胃癌組織和距腫瘤邊界2 cm處的組織(癌旁正常組織)，迅速放置于液氮中，冷凍24 h，-80 ℃冰箱儲存。

1.2.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平：研碎凍存的胃癌組織和癌旁正常組織，加TRIzol Reagent(S30876，上海源葉生物科技有限公司)以獲得總RNA；隨后用TruScript First Strand cDNA Synthesis Kit(54400-E，加拿大Norgen Biotek公司)將RNA反轉錄成cDNA，且miR-513a-3p的反轉錄采用頸環法，其逆轉錄引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACC-CTTCTCA-3′；最后，利用Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(TQ2300-01，北京索萊寶科技有限公司)及qRT-PCR儀(SLAN-96S，上海宏石醫療科技有限公司)將cDNA擴增、檢測。qRT-PCR儀擴增參數：97 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，62.8 ℃ 25 s，40個循環。miR-513a-3p、RNF6的內參分別是U6、GAPDH，引物序列如表1所示。miR-513a-3p、RNF6 mRNA相對表達量以2-ΔΔCT法計算。

表1 miR-513a-3p、U6、RNF6、GAPDH引物序列 Tab 1 Primer sequences of miR-513a-3p, U6, RNF6 and GAPDH

1.2.4 生物信息學網站預測miR-513a-3p和RNF6的關系：利用生物信息學網站(http://www.targetscan.org)預測分析miR-513a-3p與RNF6之間的關系。

1.3 隨訪對77例胃癌患者隨訪36個月，隨訪起點為胃癌患者手術當天，隨訪終點為胃癌患者死亡或隨訪至2021年5月，以微信/門診/電話隨訪為主，記錄胃癌患者生存情況。

2 結果

2.1 Ualcan數據庫中胃癌組織和癌旁正常組織RNF6 mRNA表達水平比較Ualcan數據庫中，胃癌組織RNF6 mRNA表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05，見圖1)。

圖1 Ualcan數據庫中胃癌組織、癌旁正常組織RNF6 mRNA表達水平

2.2 胃癌組織、癌旁正常組織中miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平比較胃癌組織中miR-513a-3p表達水平低于癌旁正常組織(P<0.05)，RNF6 mRNA表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05，見表2)。

表2 胃癌組織、癌旁正常組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平比較

2.3 胃癌組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平與胃癌臨床病理特征的關系分別以胃癌組織中miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平的均值0.45、2.18為臨界值，低于miR-513a-3p表達水平均值的胃癌患者為miR-513a-3p低表達組(39例)，高于miR-513a-3p表達水平均值的胃癌患者為miR-513a-3p高表達組(38例)；低于RNF6 mRNA表達水平均值的胃癌患者為RNF6低表達組(37例)，高于RNF6 mRNA表達水平均值的胃癌患者為RNF6高表達組(40例)。結果顯示，胃癌組織miR-513a-3p表達水平與淋巴結轉移、H.pylori感染、TNM分期呈負相關(P<0.05)，與胃癌分化程度呈正相關(P<0.05)；RNF6 mRNA表達水平與淋巴結轉移、H.pylori感染、TNM分期呈正相關(P<0.05)，與胃癌分化程度呈負相關(P<0.05)；而胃癌組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平與年齡、性別、腫瘤直徑無關(P>0.05，見表3)。

2.4 胃癌組織中miR-513a-3p表達水平與RNF6 mRNA的相關性Pearson法分析顯示，胃癌組織中miR-513a-3p表達水平與RNF6 mRNA呈負相關(r=-0.575，P<0.05，見圖2)；生物信息學分析顯示，miR-513a-3p與RNF6 mRNA存在靶向關系(見圖3)。

表3 胃癌組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平與胃癌臨床病理特征關系[例數(%)]Tab 3 Relationship between expression levels of miR-513a-3p and RNF6 mRNA and clinicopathological features of gastric cancer tissues [n(%)]

圖2 胃癌組織中miR-513a-3p表達水平與RNF6 mRNA的相關性

2.5 胃癌組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平與胃癌患者預后的關系對77例胃癌患者隨訪36個月，生存者54例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-513a-3p低表達組胃癌患者的平均生存時間為27.77個月(95%CI：24.65～30.89)，短于miR-513a-3p高表達組胃癌患者的平均生存時間34.61個月(95%CI：33.19～36.02)，Log-Rank檢驗結果顯示，miR-513a-3p高、低表達組胃癌患者的累積生存率比較，差異有統計學意義(χ2=13.761，P=0.000，見圖4)；RNF6低表達組胃癌患者的平均生存時間為34.27個月(95%CI：32.66～35.88)，長于RNF6高表達組胃癌患者的平均生存時間28.25個月(95%CI：25.20～31.30)，Log-Rank檢驗結果顯示，RNF6高、低表達組胃癌患者的累積生存率比較,差異有統計學意義(χ2=9.548，P=0.002，見圖5)。

圖3 生物信息學分析miR-513a-3p與RNF6 mRNA的靶向關系 Fig 3 Bioinformatics analysis of the targeting relationship between miR-513a-3p and RNF6 mRNA

圖4 胃癌組織miR-513a-3p表達水平與胃癌患者預后的關系；圖5 胃癌組織RNF6 mRNA表達水平與胃癌患者預后的關系

2.6 Cox回歸分析胃癌患者預后的影響因素單因素Cox回歸分析顯示，miR-513a-3p、分化程度是影響胃癌患者不良預后的保護因素(P<0.05)，H.pylori感染、淋巴結轉移、RNF6、TNM分期是影響胃癌患者不良預后的危險因素(P<0.05)；多因素Cox回歸分析顯示，miR-513a-3p是影響胃癌患者不良預后的獨立保護因素(P<0.05)，H.pylori感染、淋巴結轉移、RNF6、TNM分期是影響胃癌患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05，見表4)。

表4 影響胃癌患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析Tab 4 Univariate and multivariate Cox regression analysis affecting prognosis of gastric cancer patients

3 討論

胃癌早期癥狀比較隱匿，無特異性，易被漏診/誤診，且臨床多采用根治性手術治療，但胃癌患者預后較差[8-9]。因此，尋找與胃癌發病相關，且可評估胃癌患者預后的指標，對及早干預，改善胃癌患者的生存狀況有積極意義。

miRNA可調控細胞增殖、信號轉導、細胞凋亡過程，與腫瘤病理變化顯著有關[10-11]。研究發現，miR-513a-3p是miRNA中的一員，其在結直腸癌中表達水平降低，miR-513a-3p可能通過靶向己糖激酶2進而抑制結直腸癌細胞的糖酵解，其可能在結直腸癌中發揮抑癌作用[12]；另外，miR-513a-3p在胃癌中表達失調，其可能通過影響己糖激酶2進而影響胃癌發生發展[13]。本研究中胃癌組織中miR-513a-3p表達水平較低，與Wang等[13]研究趨勢一致，提示miR-513a-3p可能與胃癌發病過程相關，推測miR-513a-3p可能通過靶向調節己糖激酶2等有關基因進而影響胃癌細胞增殖、信號轉導等過程，從而在胃癌中起抑制作用，但其具體機制仍需進一步探討。此外，本研究中胃癌組織miR-513a-3p表達水平與淋巴結轉移、H.pylori感染、TNM分期呈負相關，與胃癌分化程度呈正相關，提示miR-513a-3p與胃癌疾病進展程度有關，測定胃癌組織miR-513a-3p表達有利于臨床判斷胃癌患者病情，有助于制定個體治療方案。

RNF6可調控胚胎分化，影響雄性激素受體轉錄，觸發蛋白質泛素化過程，調節蛋白質降解、細胞生長，影響信號轉導過程，與腫瘤發生相關[14-15]。研究發現，RNF6在結直腸癌中表達水平上調，其與淋巴血管浸潤等密切相關，RNF6可能是預測結直腸癌患者預后、腫瘤轉移的標志物[16]；另外，RNF6在胰腺癌中呈過表達，其可能促進有氧糖酵解過程，RNF6有望成為治療胰腺癌的潛在靶點[17]。以上研究表明，RNF6表達失調可能與消化道腫瘤發生、發展有關。本研究顯示，胃癌組織中RNF6 mRNA表達水平較高，與黃子明等[6]研究趨勢及Ualcan數據庫分析結果相似，提示RNF6 mRNA可能在胃癌中有重要作用，推測高水平RNF6 mRNA可能通過影響有氧糖酵解，引發蛋白質泛素化、調節信號轉導過程，進而在胃癌中發揮促癌作用，其機制有待深入研究證實。本研究中RNF6 mRNA表達水平與淋巴結轉移、H.pylori感染、TNM分期呈正相關，與胃癌分化程度呈負相關，提示RNF6 mRNA表達水平與胃癌病情進展相關，RNF6 mRNA可作為治療胃癌的有效靶標。

生物信息學分析顯示，miR-513a-3p與RNF6 mRNA存在靶向關系，故本文探討了胃癌組織miR-513a-3p表達水平與RNF6 mRNA的相關性，結果顯示，miR-513a-3p表達水平與RNF6 mRNA呈負相關，提示miR-513a-3p可能與RNF6 mRNA協同影響胃癌病理變化過程，但其機制仍需結合基礎研究加以探討。本研究顯示，miR-513a-3p低表達組、RNF6高表達組胃癌患者平均生存時間、累積生存率低于miR-513a-3p高表達組、RNF6低表達組，提示miR-513a-3p、RNF6 mRNA可能均與胃癌預后密切相關，miR-513a-3p表達水平越低、RNF6 mRNA表達水平越高，胃癌患者預后越差，miR-513a-3p、RNF6 mRNA有望成為評估胃癌患者預后的指標。進一步分析顯示，RNF6 mRNA表達水平升高、TNM分期增加、伴有H.pylori感染、淋巴結發生轉移、miR-513a-3p表達水平降低均會增加胃癌患者發生不良預后的風險，檢測胃癌組織miR-513a-3p、RNF6 mRNA表達水平可能有助于及時診治胃癌、預測胃癌患者預后情況。

綜上，胃癌患者癌組織miR-513a-3p表達水平較低，RNF6 mRNA表達水平較高，miR-513a-3p、RNF6 mRNA可作為預測胃癌患者預后情況的輔助指標，二者為臨床診治胃癌提供參考。但本研究樣本較少，結果可能有一定偏倚，后期需擴大樣本，分析miR-513a-3p在胃癌中與RNF6 mRNA的相關性及有關機制，為臨床診療胃癌提供更有力的依據。