肥大細胞相關G蛋白偶聯受體介導神經源性炎癥反應及宿主防御作用

邵 茗，羅和生

武漢大學人民醫院消化內科，湖北 武漢 430060

肥大細胞(mast cells，MCs)是人體先天免疫系統的重要組成部分，是機體抵御內外環境威脅的第一道防線。MCs來源于胚胎和成人骨髓[1]，低數量的MCs祖細胞在血液中循環，并可以遷移到靠近血管、淋巴管、腺體、平滑肌和神經的位置[2]。在組織中，一部分MCs作為穩態池存在，另一部分在局部微環境釋放的炎癥或細菌源分子如白細胞介素(interleukin，IL)-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-33、趨化因子配體12、轉化生長因子-β、神經生長因子、干細胞因子等的誘導下完成分化成熟的過程[3]。成熟的MCs是異質的、在組織駐留的、生存周期較長的顆粒狀細胞，在炎癥條件下通過增殖、募集、或從MCs祖細胞中發育成熟來增加數量[4]。過敏原、感染源和毒素等物質激活與IgE交聯的FcεRI受體并促使MCs迅速釋放預先形成的介質，如血管活性胺(組胺和血清素)、蛋白多糖、蛋白酶和細胞因子等，這是MCs較為常見的激活方式[5]。除此之外，MCs還能以IgE獨立的方式激活，塑造組織微環境，參與細胞和細胞之間的相互作用，并通過分泌一系列促炎和抗炎產物來防御和清除各種病原體[6]。MrgprX2是新發現分布于MCs上的特異性受體，在非IgE依賴的MCs激活中發揮重要作用，本文將綜合闡述該受體的特點、相關激動劑和激活劑以及其在神經源性炎癥和疼痛反應及宿主防御與微生物清除中的作用。

1 MrgprX2概述

1.1 MrgprX2的發現及分布G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors, GPCRs)是7個跨膜結構域受體家族中最大的一種，它們通過異三聚體G蛋白偶聯來調節細胞的重要功能，如細胞增殖、發育、生存、代謝和神經元信號傳遞。在人體中已鑒定出約800種不同的GPCRs，它們是構成真核生物最大的一類受體[7]。2001年首次報道發現MCs相關的G蛋白偶聯受體家族(Mas-related G protein-coupled receptors，Mrgprs)，這些受體在疼痛感覺神經元的一個特定子集中表達，在調節疼痛感受器功能中發揮作用[8]。

人體中有4種Mrgx基因：MrgprX1～MrgprX4。小鼠基因組包含MrgprA(A1～A10)、MrgprB(B1～B5、B8)、MrgprC(C11)、MrgprD、MrgprE、MrgprF、MrgprG、MrgprH基因，目前該受體家族的生理功能在很大程度上仍然未知[9]。MrgprX2受體在非IgE依賴的MCs激活中起到重要作用，它的分子量為37 kDa，由330個氨基酸組成，最初在背根神經節中發現，后來研究發現MCs似乎是除背根神經節外唯一表達該受體的細胞[10]。詳細的轉錄組分析顯示，MrgX2 mRNA在皮膚、脂肪組織、膀胱和結腸中最豐富，在測試的42個人類細胞系中發現僅在HMC-1中存在高水平的MrgX2和低水平的MrgX1表達，結締組織樣人臍帶血源性MCs中MrgprX2轉錄的拷貝數明顯高于黏膜樣MCs[9]。

1.2 MrgprX2的小鼠同源物對小鼠原代MCs進行嚴格的RT-PCR篩選發現了一個單一家族成員MrgprB2的條帶[11]，異源性表達 MrgprB2的HEK293細胞(MrgprB2-HEK)能被MrgprX2激動劑化合物48/80(Compound 48/80，C48/80)激活[12]，MrgprB2-HEK細胞也對其他MrgprX2配體有應答，包括基本的促分泌物質P(substance P，SP)。通過構建MrgprB2 BAC轉基因小鼠發現MrgprB2高度特異性表達在結締組織MCs上[13]，這些藥理和基因表達數據強烈表明，MrgprB2是MrgprX2的小鼠同源物。但研究發現MrgprX2和MrgprB2的激活所需的激動劑濃度有很大的不同，大多數MrgprB2配體產生半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)明顯高于MrgprX2配體，如C48/80激活MrgprB2的EC50為3.7 μg/ml，但它激活MrgprX2的EC50為470 ng/ml[13]。

2 MrgprX2的激動劑

2.1 陽離子肽類藥物MrgprX2能被具有陽離子性質的配體激活，這些配體是具有不同化學特征的肽、蛋白質、半胱氨酸蛋白酶和阿片類物質[14]，如抗菌宿主防御肽、神經肽、嗜酸性粒細胞顆粒蛋白及許多FDA批準的肽類藥物等[13]。研究[13]發現，FDA批準的肽類藥物中，絕大多數與注射部位反應(injection-site reaction，ISRs)相關的是陽離子的藥物，ISRs是一種在注射藥物部位產生的局部腫脹反應，可伴有疼痛或瘙癢。除了胰島素以外所有常見的、市售的這些陽離子藥物的代表性成員都以MrgprB2依賴的方式激活MCs，并且除了胰島素，所有這些肽都能激活MrgprB2-HEK和MrgprX2-HEK細胞。作為這些藥物中具有代表性的一種，艾替班特幾乎在每例患者中都能引起ISRs，并且能在野生型小鼠中引起廣泛的外滲和腫脹，產生類似于人類的ISRs，但在MrgprB2敲除的小鼠中未出現這種現象。艾替班特能促進野生型小鼠腹膜MCs釋放組胺，但在MrgprB2敲除的小鼠中組胺的釋放出現明顯減少[13]。這表明藥物誘導的ISRs可能通過靶向MrgprX2或使用具有較弱的MrgprX2激動劑特性的多肽來緩解。

2.2 非特異性激動劑偽過敏反應癥狀包括皮膚潮紅或皮疹、血壓或心率變化和支氣管痙攣，通過MrgprB2介導小分子誘導的偽過敏反應的實驗，研究者發現，一個含有四氫異喹啉(tetrahydroisoquinoline,THIQ)基元的環化突變體促使MCs脫顆粒的效應是C48/80的7倍[15]，在對FDA批準的含有THIQ的藥物的檢索中發現了煙堿受體拮抗劑非甾體神經肌肉阻斷藥物(non-steroidal neuromuscular blocking drugs，NMBDs)的成員，除琥珀膽堿外，所有NMBD家族成員以MrgprB2依賴的方式激活MCs[13]。研究發現，SP為一種內源性的MrgprB2激動劑，能夠通過MrgprB2促進免疫細胞的遷移，SP還通過MrgprX2受體激活MCs，導致了多種炎性細胞因子和趨化因子的釋放，并且SP介導的炎癥反應獨立于其典型受體神經激肽-1受體(neurokinin-1 receptor, NK-1R)，這些結果證實了MrgprB2/X2受體可作為一種重要的神經免疫調節劑和治療炎性疼痛的潛在靶點[16]。SP和許多其他神經肽，包括皮質抑素、生長抑素、血管活性腸肽和腎上腺髓質素前體 (Proadrenomedullin，PAMP)-20和PAMP-12，都是MrgprX2激動劑，它們通過激活MrgprX2增加MCs細胞內鈣濃度，并以劑量依賴的方式使MCs脫粒[17]。

2.3 選擇性MrgprX2探針目前尚不清楚是否有特異性MrgprX2激動劑，明確的選擇性、強效的MrgprX2激動劑探針的鑒定是揭示其體內外功能的重要一步，研究者們利用高通量、大規模并行篩選潛在調節劑(包括小分子、生物活性肽和其他試劑)，然后通過計算建模篩選更廣泛的化學結構，發現了選擇性MrgprX2探針ZINC-3573[18]，這種激動劑特異性地通過MrgprX2促進MCs脫顆粒，在超過315種其他GPCRs中無明顯的激動作用，MrgprX2 siRNA顯著降低(R/S)-ZINC-3573誘導的脫顆粒。目前的研究表明，MrgprX2激動劑在瘙癢性皮膚病中發揮重要作用，不同的MrgprX2激動劑在MCs的活化、釋放信號分子和免疫細胞的募集中有不同的作用，但針對MrgprX2特異性的有效的激動劑仍有待研究。

3 MrgprX2的拮抗劑

3.1 雜環化合物MrgprX2是一種獨特的GPCR，它對多種肽和化合物具有廣泛的反應性，因此，該受體也缺乏特異性的拮抗劑。研究者通過對分子庫中的化合物進行篩選發現兩種不同的雜環化合物，兩種化合物均能阻斷SP誘導的細胞內Ca2+動員，此外這兩種化合物都能有效阻止SP與MrgprX2的結合，抑制由SP介導的前列腺素D2的產生，該研究預測MrgprX2拮抗劑可能是一種很有前景的治療IgE非依賴性過敏反應的藥物[19]。

3.2 紫草素研究[20]發現，紫草素預處理的MrgprX2-HEK293細胞表現出劑量依賴性的細胞活化抑制，采用分子對接來研究MrgprX2和紫草素之間的結構，球面空間場模型顯示紫草素與MrgprX2的活性腔體吻合較好，紫草素與MrgprX2通過形成4個氫鍵相互作用。紫草素能有效抑制MCs的激活，這與MrgprX2介導的PLCγ-PKC-IP3信號通路的抑制有關，提示紫草素可能是一種潛在的治療過敏性和炎性疾病的新藥。

3.3 QWFMCs上的NK-1受體拮抗劑Gln-D-Trp(Formyl)-Phe benzyl ester(QWF)能抑制C48/80誘導的MCs脫顆粒和分泌素誘導的瘙癢[21]。QWF還抑制了LAD2中δ毒素誘導的脫顆粒作用，并且QWF顯著降低了萬古霉素誘導的LAD2的脫顆粒作用[22]。QWF可視為人類和小鼠體內外Mrgprs的拮抗劑。

3.4 芍藥苷(Paeoniflorin，PF)PF是一種從白芍水提物中分離得到的單萜苷類化合物[23]，具有抗炎作用。研究[24]發現，PF能以劑量依賴的方式抑制C48/80誘導的MCs脫顆粒。此外，PF可以減少C48/80誘導的鈣內流，并抑制體外MCs脫粒和趨化因子的釋放，該化合物可以作為MrgprX2抑制劑，影響MrgprX2誘導的偽過敏性藥物反應的信號通路傳遞。

3.5 CD300f一種抑制性受體CD300f，也被稱為骨髓細胞表達的免疫受體1，是CD300家族的I型跨膜糖蛋白成員，通過與其生理配體神經酰胺結合來抑制IgE依賴的過敏反應[25]，角氨胺CD300f相互作用可以抑制ATP或LPS誘導的MCs激活[26]。為了檢測CD300f是否調節MrgprB2介導的MCs激活，研究者從野生型和CD300f-/-小鼠中分離出腹膜MCs，兩者都表達了同等水平的FcεRI和C-Kit受體，在涂有神經酰胺、磷脂酰膽堿等載體的孔板內用C48/80刺激野生型小鼠和CD300f-/-腹膜MCs，發現C48/80刺激的MCs脫顆粒僅在野生型小鼠中被抑制，這表明CD300f抑制MrgprX2介導的偽過敏反應，CD300f可能是MCs介導過敏反應的潛在治療靶點[27]。

4 MrgprX2介導神經源性疼痛和炎癥反應及宿主防御與微生物的清除

4.1 MCs-神經的相互作用神經和免疫系統在調節維持生理內穩態、反應急性應激源和防止外部病原體入侵的過程中起著關鍵作用，MCs是先天免疫系統的多功能組成部分，現在通常被認為是典型的神經免疫細胞，利用神經肽、細胞因子和激素的共同作用在系統之間進行交流[28]。在負責疼痛傳遞的感覺神經纖維支配的組織中MCs數量較多，這些MCs和神經之間的解剖聯系在炎癥部位更為明顯[29]。MCs和神經之間多通過細胞之間的旁分泌信號進行交流，當二者解剖位置接近時，MCs還可以通過介質與神經交流，MCs和神經也可以形成物理突觸，通過整合素結合來調節細胞表型和功能[28]。

在過敏性炎癥中，有研究[30]認為IgE介導的MCs激活釋放胰蛋白酶，激活感覺神經元上蛋白酶受體，導致瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential cation channel subfamily V number 1，TRPV1)致敏，并增加痛覺，同時刺激SP和降鈣素基因相關肽的釋放。釋放的神經肽誘導MCs的進一步激活，導致小動脈血管舒張，增加血流和中性粒細胞、巨噬細胞和T細胞的募集，從而加強炎癥反應[30]。MCs誘導腸神經元的激活導致黏膜分泌升高和腸動力增加。此外MCs介質，特別是組胺和蛋白酶通過TRPV1來增加黏膜下傳入神經元的敏感性，導致腸道機械擴張和內臟疼痛感知的增加[31]。

4.2 MrgprX2(MrgprB2)介導神經源性炎癥和疼痛SP是MCs與神經交流中研究最全面的介質，由SP誘導的MCs激活是一系列與疾病相關的神經源性炎癥的關鍵。除了通過經典的NK-1受體激活MCs外，SP還可以激活MrgprX2導致MCs脫顆粒。MCs受體MrgprB2的激活是神經肽誘導的免疫細胞募集的關鍵驅動因素，研究者使用術后疼痛模型發現MrgprB2-/-小鼠的機械超敏性和熱超敏性都降低，募集的炎癥細胞數量顯著降低。SP激活MrgprX2后，腫瘤壞死因子α、集落刺激因子和IL-8釋放顯著增加。并且NK-1-/-小鼠在SP誘導后募集的免疫細胞數量無顯著減少，表明MrgprB2是參與SP誘導先天免疫細胞募集的主要受體。MrgprB2是組織損傷后神經元信號傳導的主要下游效應受體，SP通過MrgprB2而不是NK-1R促進免疫細胞募集的發現為治療炎癥和疼痛提供了一個新的靶點[16]。

4.3 MrgprX2(MrgprB2)介導宿主防御與微生物的清除宿主防御肽(host defense peptides, HDPs)如LL-37和人β防御素(human β-defensins，hBDs)，對清除微生物病原體至關重要，在宿主防御系統中發揮重要作用。研究[32]發現，從上皮細胞中衍生出來的hBDs通過MrgprX2激活了MCs，LL-37由激活的MCs和中性粒細胞產生，反過來通過MrgprX2激活MCs。HDPs通過MrgprX2激活MCs可能會有助于微生物的清除并促進傷口愈合，微生物感染導致hBDs的產生，并通過MrgprX2導致MCs的趨化和脫顆粒。MCs衍生的介質會增加血管通透性，并促進中性粒細胞的募集，中性粒細胞釋放的LL-37激活了MrgprX2，增強了Toll樣受體4的表達，并導致了MCs進一步的趨化和脫顆粒[32]。

群體感應是一種細胞與細胞的交流機制，被細菌用于協調控制抗生素耐藥性、生物膜形成和毒力大小，該過程由群體感知分子(quorum-sensing molecules，QSMs)進行介導。研究[33]發現，MrgprB2及MrgprX2是革蘭陽性QSMs的受體，能力刺激肽(competence-stimulating peptide，CSP)-1是QSMs中的一種，它激活MrgprB2和MrgprX2，觸發MCs脫顆粒，抑制細菌生長，阻止生物膜的形成，這種抗菌功能在MrgprB2缺乏的MCs中被降低。MrgprB2敲除小鼠的細菌清除率降低，而在體內激活MrgprB2可以消除細菌并提高疾病評分，MrgprX2可作為控制細菌感染的潛在治療靶點[33]。

4.4 MrgprX2下游信號通路研究[34]發現,從黃蜂毒液中分離出來馬斯多帕蘭可以通過MrgprX2受體激活MCs，并以劑量依賴的方式誘發MCs脫顆粒并引起中性粒細胞的募集，MrgprX2等GPCR可以與多個Gα亞基相互作用，以啟動不同的信號通路。馬斯托帕蘭特異性激活Gαq，即激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)的亞基，并檢測到PLCγ1的磷酸化，導致了三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)的產生，這是動員MCs脫顆粒所需的關鍵第二信使[34]。在一項對潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)患者腸道標本的研究中，研究者比較了急性炎癥和非炎癥部位的UC組織，僅在炎癥組織中發現MrgprX2特異性激活，并且炎癥部位MrgprX2激動劑的蛋白溶解前體PAMP-12增加，從炎癥組織中分離出來的MCs中胰蛋白酶的分泌增多。通過批量RNA序列分析和單細胞RNA序列等對可改變GPCRs中蛋白質的等位基因進行篩選，發現一種Asn62Ser等位基因可對UC產生保護作用，含有Asn62Ser的MCs在激動劑刺激后β-arrestin募集增加，IP1積累減少，PERK表達增加，對UC患者來說阻斷MrgprX2激活和蛋白酶釋放是一種很有前景的靶向治療方法[35]。

在過去的十幾年中，我們對Mrgprs有了初步的了解：(1)小鼠MrgprA3亞型被確定為氯喹介導的瘙癢作用的受體；(2)嚙齒動物的MrgprC負責止痛和增強疼痛的雙重作用，也被證明參與瘙癢的發生；(3)MrgprD增強神經元興奮性并誘導血管舒張；(4)人類MrgprX調節初級感覺神經元的興奮性和這些細胞的基因表達[36]。基于最近發現的MrgprX2(MrgprB2)參與肽類藥物誘導的偽過敏反應，MrgprB2功能缺失的小鼠及其野生型小鼠將是臨床前篩選新的肽類藥物和治療偽過敏反應實驗的有用工具。MrgprX2及其激動劑可能是皮膚疾病或藥物反應的一個很有前景的靶點，MrgprX2拮抗劑最近已被發現能夠完全抑制人臍帶血來源的MCs的脫粒[19]和減少C48/80誘導的小鼠局部過敏性炎癥[24]。但目前MrgprX2仍然缺乏有效的特異性的激動劑和拮抗劑，并且對于MrgprX2的下游信號通路的激活我們仍然有很多不了解，MrgprX2在除了偽過敏反應中的其他疾病中的作用尚不明確，關于MrgprX2在神經源性炎癥和疼痛反應中的作用的認識應該進一步擴大。