復(fù)合酶法改性姜渣不溶性膳食纖維及抗氧化活性研究

白冉冉，宋明發(fā)，章乾，陳澤雨，莊乾飛，尚祖飛，馬立志，2*

(1.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)中心，貴陽 550005)

小黃姜是姜科姜屬草本植物，比普通生姜纖維更多且更細(xì)小[1]，不僅是被廣泛使用的一種調(diào)味品，還具有很好的藥用價(jià)值，可抗氧化[2]、抗衰老[3]、降血脂、抗腫瘤[4]等,屬于藥食同源植物。目前，與姜的姜辣素、蛋白質(zhì)、多糖的研究相比，對(duì)膳食纖維的研究較少。在生產(chǎn)加工中會(huì)產(chǎn)生很多姜渣，姜渣中富含膳食纖維，若不加以應(yīng)用會(huì)造成一定的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

膳食纖維作為第七營養(yǎng)素[5]，具有改善腸道疾病、降血脂等多種生理作用。按照水溶解性不同，分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維[6]。優(yōu)質(zhì)膳食纖維的SDF含量應(yīng)達(dá)到10%，SDF具有更好的溶解性、黏度特性和良好的抗氧化活性[7]，能發(fā)揮更強(qiáng)的生理活性[8]，具有改善心腦血管疾病[9]和腸道環(huán)境[10]、調(diào)節(jié)血糖和血脂[11-12]等保健功能。然而，天然膳食纖維的SDF含量相對(duì)較低，因此，需要改性以提高SDF含量，酶法因反應(yīng)溫和、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[13]。本研究以小黃姜姜渣不溶性膳食纖維為原料，采用復(fù)合酶法改性得到可溶性膳食纖維，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行分析，為開發(fā)利用高附加值姜渣提供一定的理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小黃姜：貴州省黔堂姜生物科技有限公司；木聚糖酶、纖維素酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、抗壞血酸等均為國產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；pH計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì) 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；FW80-1小型粉碎機(jī) 泰斯特(天津)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不溶性膳食纖維的制備

稱取3 g姜渣(60目)，加入蒸餾水后煮沸3 min，使淀粉充分糊化，溫度降至60 ℃，調(diào)節(jié)pH為4.5，加入0.3%的α-淀粉酶，酶解90 min，調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度降至40 ℃，加入0.06%的木瓜蛋白酶，酶解90 min，滅酶5 min，4 000 r/min離心15 min后將沉淀洗滌3次，抽濾，烘干至恒重后稱重，即得不溶性膳食纖維(IDF)。

1.2.2 復(fù)合酶法改性不溶性膳食纖維

1.2.2.1 改性工藝

稱取制備的IDF配成懸液，調(diào)節(jié)pH值，加入一定量復(fù)合酶(纖維素酶和木聚糖酶)，在一定溫度下酶解，滅酶5 min，5 000 r/min離心15 min后將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/3，用4倍無水乙醇醇沉一夜，收集沉淀，烘干至恒重即得可溶性膳食纖維(SDF)。根據(jù)式(1)計(jì)算SDF得率：

(1)

1.2.2.2 單因素試驗(yàn)

考察復(fù)合酶比例(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、pH值(4.5，5，5.5，6,6.5)、復(fù)合酶添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解溫度(45，50，55，60，65 ℃)、酶解時(shí)間(40，60，80，100，120 min)對(duì)SDF得率的影響。

1.2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、pH值(D)4個(gè)因素為自變量，可溶性膳食纖維得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)四因素三水平的模型,確定最優(yōu)改性工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface analysis

續(xù) 表

1.2.2.4 膳食纖維含量測定

采用GB 5009.88-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》中的方法測定SDF含量和IDF含量[14]。

1.2.3 抗氧化活性測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除率測定

加入DPPH自由基溶液2 mL和2 mL不同質(zhì)量濃度(2，4，6，8，10 mg/mL)的提取液，混勻后避光30 min，于517 nm處測吸光值A(chǔ)1；用無水乙醇分別代替DPPH·溶液和樣液，分別測定吸光值，記為A2、A0。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照[15]。根據(jù)式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(2)

1.2.3.2 ABTS自由基清除率測定

加入0.4 mL待測液(2，4，6，8，10 mg/mL)和3.6 mL ABTS自由基工作液，室溫下暗反應(yīng)6 min，于734 nm處測吸光值A(chǔ)1；以無水乙醇代替ABTS自由基工作液，測其吸光值A(chǔ)2,空白對(duì)照組吸光值為A0。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照[16]。根據(jù)式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率：

(3)

1.2.3.3 羥基自由基清除率測定

吸取不同質(zhì)量濃度的樣品，加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，6 mmol/L H2O21 mL，充分振蕩搖勻后，于37 ℃反應(yīng) 30 min，于510 nm處測定其吸光值A(chǔ)1，以蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光值A(chǔ)2,以蒸餾水代替樣液測定吸光值A(chǔ)0。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照[17]。根據(jù)式(4)計(jì)算羥基自由基清除率：

(4)

1.2.3.4 總還原力

將0.5 mL樣液(2，4，6，8，10 mg/mL)和1 mL 0.2 mol/L的pH為6.6的PB溶液搖勻，加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃水浴20 min，然后加入1 mL 10%三氯乙酸混勻，離心10 min，將上清液2.5 mL、蒸餾水2.5 mL、0.1%三氯化鐵1 mL混合均勻，于700 nm[18]處測吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert V8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Orign 8.5軟件作圖，采用SPSS 25.0中的Duncan進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05和P<0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶比例對(duì)姜渣SDF得率的影響

圖1 復(fù)合酶比例對(duì)姜渣SDF得率的影響Fig.1 Effect of ratio of complex enzyme on the yield of SDF from ginger residue注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下圖同。

由圖1可知，當(dāng)纖維素酶∶木聚糖酶為1∶1時(shí)，SDF得率最大，木聚糖酶與纖維素酶之間的比例相差越大，SDF得率越小，這可能是因?yàn)槔w維素酶可以將纖維素水解成半纖維素，而木聚糖酶作用于半纖維素。因此，復(fù)合酶比例為1∶1是最佳酶配比。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)姜渣SDF得率的影響

圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)姜渣SDF得率的影響Fig.2 Effect of complex enzyme addition amount on the yield of SDF from ginger residue

由圖2可知，SDF得率隨著復(fù)合酶添加量的增加而逐漸升高，當(dāng)加酶量為4%時(shí)得率最高，加酶量大于4%時(shí)得率下降了2.58%(P<0.05)。原因可能是過量的酶會(huì)使部分SDF降解成小分子，醇沉?xí)r以沉淀析出[19]。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)姜渣SDF得率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)姜渣SDF得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield of SDF from ginger residue

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，SDF得率先升高后降低，80 min時(shí)得率最高，為42.25%。40～60 min時(shí)酶解時(shí)間短，酶解不完全，得率相對(duì)較低；酶解時(shí)間大于80 min后，SDF會(huì)降解為親水小分子，逐漸溶解于水中[20]，造成SDF得率下降。

2.1.4 酶解溫度對(duì)姜渣SDF得率的影響

圖4 酶解溫度對(duì)姜渣SDF得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of SDF from ginger residue

由圖4可知，在45～55 ℃范圍內(nèi)，SDF得率持續(xù)增加，升高溫度能夠增加水分子運(yùn)動(dòng)速率，促進(jìn)酶反應(yīng)[21]。55 ℃時(shí)得率最高，為38.89%。溫度大于55 ℃后SDF得率持續(xù)下降，說明當(dāng)溫度過高時(shí)酶失活，使酶的水解反應(yīng)變慢。

2.1.5 酶解pH對(duì)姜渣SDF得率的影響

圖5 pH對(duì)姜渣SDF得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of SDF from ginger residue

由圖5可知，pH值為6.0時(shí)，SDF得率最大，為44.02%，提取率顯著高于其他pH條件(P<0.05)，表明酶在最適pH時(shí)具有最高酶活，pH減小會(huì)阻礙被包裹著的水溶性膳食纖維釋放以及自身降解[22]，進(jìn)而使得SDF得率下降；pH過大會(huì)引起SDF結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而影響SDF得率。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多因素復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

通過四因素三水平中心試驗(yàn)分析，以復(fù)合酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、pH(D)為自變量,可溶性膳食纖維得率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。

用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行二次線性回歸擬合,方程如下：

Y=47.99-0.61A-0.066B-0.21C+0.83D+0.025AB-1.17AC+0.47AD+0.080BC+0.027BD+0.39CD-1.63A2-1.03B2-1.68C2-2.95D2。由該方程可知，二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2的系數(shù)均為負(fù)值，說明該方程存在最大值。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

2.2.2 回歸模型建立與討論

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

由表3可知，模型的F值為6.79，模型的P值為0.000 5，說明該模型極顯著，且失擬項(xiàng)的P值為 0.372 6>0.05，不顯著，表明此模型的擬合程度較好。對(duì)該回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，由檢驗(yàn)結(jié)果可知，影響極顯著的有：A2、C2、D2，影響顯著的有：A、D、AC、B2。從F值來看，影響SDF得率的4個(gè)因素主次順序?yàn)镈>A>C>B，即pH>復(fù)合酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間。

2.2.3 交互效應(yīng)分析

復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH之間的交互作用對(duì)SDF得率的影響見圖6。

a

由圖6可知，AC交互作用最強(qiáng)，表明復(fù)合酶添加量和酶解溫度對(duì)SDF得率的影響最大。隨著復(fù)合酶添加量的增加，SDF得率先上升后下降，且復(fù)合酶添加量響應(yīng)曲面較陡，其影響程度大于酶解溫度。隨著復(fù)合酶添加量和pH的增加，SDF得率先上升后下降，且pH響應(yīng)曲面較陡，其影響程度大于復(fù)合酶添加量。因此，在試驗(yàn)操作過程中，應(yīng)該充分考慮因素之間的交互作用，控制好各因素添加量，以保證SDF得率。

2.2.4 最佳方案確定與驗(yàn)證

通過對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到復(fù)合酶法改性的最佳工藝條件為復(fù)合酶添加量3.83%、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度55 ℃、pH 6.06，為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可靠性，在上述優(yōu)化得到的工藝參數(shù)下進(jìn)行3次試驗(yàn)，SDF平均得率為(48.27±0.06)%，與理論值非常接近，具有良好的重復(fù)性。結(jié)果表明，該回歸模型可行。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

圖7 姜渣SDF的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging capacity of SDF from ginger residue

由圖7可知，在2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，SDF的DPPH清除能力呈增長趨勢，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，SDF的DPPH自由基清除率為66.03%，IC50值為4.077 mg/mL，在該范圍內(nèi)抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率都達(dá)到了90%以上，表明SDF有清除DPPH自由基的能力，但遠(yuǎn)低于抗壞血酸。

2.3.2 ABTS自由基清除能力

圖8 姜渣SDF的ABTS自由基清除能力Fig.8 ABTS free radical scavenging capacity of SDF from ginger residue

由圖8可知，隨著濃度的增加，SDF的 ABTS自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到99.53%，IC50值為1.339 mg/mL，與抗壞血酸清除率相當(dāng)，表明其對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除作用，可作為一種新型的天然抗氧化劑。

2.3.3 羥基自由基清除能力

圖9 姜渣SDF的羥基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of SDF from ginger residue

由圖9可知，羥基自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)。質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，SDF的清除率為93.97%，IC50值為1.125 mg/mL，可以看出，SDF在低濃度時(shí)羥基自由基清除能力雖不及抗壞血酸，但在樣品濃度為10 mg/mL時(shí)具有較好的清除效果。

2.3.4 總還原力測定

圖10 姜渣SDF的總還原能力Fig.10 Total reducing power of SDF from ginger residue

吸光值越大表明總還原力越強(qiáng)。由圖10可知，隨著濃度增大，吸光值越來越大，1 mg/mL時(shí)吸光值達(dá)到了0.21，而抗壞血酸的吸光值達(dá)到0.47，可以看出，樣品總還原力雖低于抗壞血酸，但也具有一定的總還原能力。

3 結(jié)論

采用復(fù)合酶法對(duì)不溶性膳食纖維改性，在單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)中得到最優(yōu)工藝為復(fù)合酶比例1∶1、復(fù)合酶添加量3.83%、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度55 ℃、pH 6.06，SDF得率為48.27%。抗氧化結(jié)果表明，SDF對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的清除率的IC50值分別為4.077，1.339，1.125 mg/mL，吸光值在1 mg/mL時(shí)達(dá)到0.21，說明其具有一定的抗氧化活性。該工藝結(jié)果在很大程度上提高了SDF得率，為改性可溶性膳食纖維和后續(xù)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。