不同寄主植物桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育毒性及機制研究

劉佳莉，夏玉蘋，陳柳燕，劉舒寧，李健華，汝 梅*，李永華*

不同寄主植物桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育毒性及機制研究

劉佳莉1, 2，夏玉蘋1，陳柳燕1，劉舒寧1，李健華3，汝 梅1*，李永華1*

1. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200 2. 廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200 3. 廣西梧州神農良品農業科技有限公司，廣西 梧州 543213

研究不同寄主植物桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育毒性及其機制，為桑寄生用藥安全提供理論依據。以受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）正常發育的斑馬魚胚胎為動物模型，將桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹6種寄主植物桑寄生水提物各設置低、中、高3個藥物濃度，分別處理斑馬魚胚胎，檢測72 hpf孵化仔魚的心臟形態、心率、心包面積、靜脈竇（sinus venosus，SV）和動脈球（bulbus arteriosus，BA）間距、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、心肌細胞的凋亡情況以及氧化應激相關酶基因［、、谷胱甘肽S-轉移酶2（glutathione S-transferase 2，）]、心臟發育相關基因[GATA結合蛋白5（GATA binding protein 5，）、NK2同源框5（NK2 homeobox 5，）、肌球蛋白重鏈6（Myosin，heavy chain 6，）]及心肌細胞凋亡相關基因[B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）]的表達水平。與空白組比較，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎均出現不同程度的心包水腫、心率降低、心包面積和SV-BA間距增大（＜0.05、0.01），SOD和CAT活性降低（＜0.05、0.01），、、、、、的表達表現出明顯的上調或下調（＜0.05、0.01）。夾竹桃、苦楝和漆樹3種寄主桑寄生還觀察到心肌細胞凋亡，表達和/值明顯降低（＜0.05、0.01）。桑寄生對斑馬魚胚胎心臟發育毒性具有明顯的寄主相關性，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現出不同程度的心臟發育毒性，寄主植物不同，毒性機制也不同。

桑寄生；寄主；斑馬魚；心臟發育毒性；氧化應激；凋亡

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生(DC.) Danser的干燥帶葉莖枝，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元的功效，用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經多、妊娠漏血、安胎不動、頭暈目眩等[1]。桑寄生屬于半寄生植物藥材，其寄主植物種類具有復雜多樣性的生物特征，《中藥大辭典》記載其寄主植物種類有29科50余種[2]。朱開昕等[3]對廣西地區桑寄生寄主植物調查發現，廣西境內的桑寄生寄主植物種類多達36科150多種。研究表明，寄主植物會通過向其桑寄生轉移屬于寄主植物的特征性成分從而對藥材質量產生影響，包括轉移寄主植物有毒成分至桑寄生使藥材產生寄主樣毒性[4]。《中國藥典》通過對桑寄生進行強心苷成分的排除性檢查，即僅排除可能來源于含強心苷的寄主植物的桑寄生，其他任何不含強心苷的寄主植物都有可能成為桑寄生藥材來源的寄主植物，桑寄生屬于多寄主植物種類來源的藥材。

臨床上強心苷通常用于慢性心力衰竭、心律失常等疾病治療，但其使用安全范圍十分狹窄并具有一定心臟毒性[5-6]。《中國藥典》2020年版要求對桑寄生進行強心苷排除性檢查，其主要目的也是防范含強心苷寄主植物來源的桑寄生，尤其是將其作為安胎功效使用時，防范藥材可能發生胎兒心臟毒性。劉人源等[7]和柴子舒等[8]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對來源于夾竹桃寄主的桑寄生和紅花寄生L.及其寄主夾竹桃進行強心苷類化合物鑒定發現，夾竹桃寄主植物能將其特有的強心苷成分向桑寄生和紅花寄生轉移。周芳等[9]對來源于夾竹桃寄主紅花寄生對離體衰竭蛙心強心作用研究發現紅花寄生會表現出寄主樣的強心作用。本課題組前期采用桑樹、漆樹、油茶等6種寄主的桑寄生水提物對斑馬魚仔魚肝毒性進行研究，發現除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現出不同程度的肝臟毒性[10]。本研究對桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生進行斑馬魚胚胎心臟發育毒性研究，探討寄主對桑寄生心臟發育毒性影響及其機制，為規范寄主來源和保障桑寄生用藥安全提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

AB系野生型斑馬魚，由廣西中醫藥大學中-加斑馬魚中藥篩選聯合實驗室提供，斑馬魚飼養及繁殖參照《》。將健康的雌雄AB系野生型斑馬魚成魚在28 ℃、光照14 h/黑暗10 h的條件下分開飼養，每天喂2次豐年蝦，實驗前一晚，將健康的AB斑馬魚成魚，按雌雄1∶2放入底部有篩網的交配缸內，用透明隔板隔開，次日清晨移除隔板，產卵1 h內觀察產卵量并收集魚卵，用胚胎水沖洗數次，在體視顯微鏡下挑選受精發育正常的胚胎用于心臟發育毒性實驗。

1.2 藥材

桑樹L.、柳樹L.、油茶Abel.、夾竹桃Mill.、苦楝L.和漆樹(Miq.) O. Kuntze 6種寄主桑寄生藥材，經廣西中醫藥大學李永華研究員鑒定，其藥材基原植物為桑寄生科植物桑寄生(DC.) Danser，將采集的桑寄生樣品室溫陰干后再于45 ℃烘箱烘2 h，藥材密封保存，備用。樣品的采集信息見表1。

1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉（批號20181113）購自天津市大茂化學試劑廠；魚安定（批號212-956-8）購自常州桌燊醫藥化工材料有限公司；逆轉錄試劑盒（批號00422877）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Eastep?Super總RNA提取試劑盒（批號0000394772）、Go Taq?qPCR Master Mix（批號0000480098）購自普洛麥格生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20200804）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號20200928、20200927）購自南京建成生物科技有限公司。

表1 不同寄主桑寄生藥材的樣品信息

1.4 儀器

Z-A-D5x型斑馬魚養殖系統（上海海圣生物實驗設備有限公司）；EP64C型1/10萬電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；SZX2-ILLT型體視顯微鏡（日本Olympus公司）；M165FC型熒光立體顯微鏡（德國Leica公司）；SpecteaMax M5e型多功能酶標儀（美國Molecular Devices）；ST16R型低溫高速離心機、NanoDrop 2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Alpha 1-4LDplus型冷凍干燥機（上海博登生物科技有限公司）；Light Cycler 96型熒光定量PCR儀（Roche公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 桑寄生水提物的提取與制備 分別稱取桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹6種寄主桑寄生各75 g，分別加10、8、6倍量蒸餾水煎煮保持微沸狀態45 min，合并3次濾液，濃縮成為浸膏，冷凍干燥，分別得到桑樹、漆樹、油茶、柳樹、苦楝和夾竹桃寄主桑寄生水提物凍干粉末11.80、13.31、12.60、14.81、16.65、14.85 g。

分別準確稱取桑樹、漆樹、油茶、柳樹、苦楝和夾竹桃6種寄主桑寄生水提物凍干粉末0.16、0.18、0.17、0.20、0.22、0.20 g（相當于生藥1.00 g），分別加入胚胎水，超聲溶解，轉移至100 mL量瓶中，定容，得生藥質量濃度為10 mg/mL的水提物貯備液母液，分裝，凍存，備用。

2.1.2 斑馬魚胚胎水溶液配制 按照斑馬魚國際資源中心（Zebrafish International Resource Center）養殖要求配制斑馬魚胚胎水，配制磷酸氫二鈉0.25 mol/L、氯化鈉0.14 mol/L、氯化鉀5.40 mol/L、無水氯化鈣1.30 mol/L、磷酸二氫鉀0.44 mol/L、無水硫酸鎂1.00 mol/L、碳酸氫鈉4.20 mol/L的水溶液。

2.2 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育的毒性劑量研究

2.2.1 桑寄生水提物對斑馬魚胚胎發育毒性影響預實驗 在體視顯微鏡下選取受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）發育正常的斑馬魚胚胎，并轉移至含有不同質量濃度桑寄生水提物胚胎水的12孔板中，每孔10枚胚胎，設置3個復孔，置28 ℃恒溫培養箱中培養，每隔24 h更換1次含相應桑寄生藥液質量濃度的胚胎水，培育至72 hpf，統計不同寄主桑寄生的斑馬魚胚胎孵化和胚胎死亡情況，得出6種寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎最小全致死濃度（LC100）和最大全不致死濃度（LC0）。

2.2.2 桑寄生水提物對斑馬魚胚胎發育毒性影響研究 根據預實驗結果，分別在不同寄主桑寄生水提物的LC100與LC0范圍內設置6個梯度藥物質量濃度組，其中桑樹寄主桑寄生6個藥物質量濃度組為9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00 mg/mL，柳樹寄主桑樹寄生6個藥物質量濃度組為6.00、5.20、4.40、3.60、2.80、2.00 mg/mL，油茶寄主桑寄生6個藥物質量濃度組為5.00、4.12、3.24、2.36、1.48、0.60 mg/mL，夾竹桃寄主桑寄生6個藥物質量濃度組為2.00、1.70、1.40、1.10、0.80、0.50 mg/mL，苦楝寄主桑寄生6個藥物質量濃度組為2.00、1.70、1.40、1.10、0.80、0.50 mg/mL，漆樹寄主桑寄生6個藥物質量濃度組為0.60、0.52、0.44、0.36、0.28、0.20 mg/mL，空白組為不含有任何桑寄生藥物的胚胎水。每孔10枚，設置3個復孔，每孔體積為4 mL，每隔24 h更換1次含有相應藥物質量濃度的胚胎水，72 h統計各質量濃度斑馬魚胚胎孵化率和死亡率。通過Graphpad prism 8.0軟件繪制量-毒曲線，計算出6種寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎10%致死濃度（LC10）。根據上述實驗得出的LC0和LC10，確定開展斑馬魚胚胎心臟發育毒性研究的不同寄主植物桑寄生藥物劑量。

2.3 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心臟毒性的影響

將不同寄主桑寄生水提物分別以1/2LC10、LC0和LC10設置為桑寄生水提物低、中、高3個質量濃度組，以觀察各劑量組的心臟毒性情況，以不含任何桑寄生藥物的胚胎水為空白組。在體視顯微鏡下挑選受精后發育正常6 hpf的斑馬魚胚胎，隨機分組移入6孔板中，每孔30枚，每孔體積為6 mL，給藥后置28 ℃的恒溫培養箱培養，每隔24 h更換1次含有相應藥物質量濃度的胚胎水，培養至72 hpf時移除藥液，用胚胎水清洗3次，滴入0.05%的魚安定溶液將其麻醉，用3%甲基纖維素鈉固定斑馬魚仔魚，仔魚側臥，在體視顯微鏡下觀察和拍照，并錄像記錄1 min內斑馬魚仔魚心跳次數，用Image-J軟件測量仔魚心包面積和靜脈竇（sinus venosus，SV）和動脈球（bulbus arteriosus，BA）間距。

2.4 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚體內SOD和CAT活性的影響

給藥方法同“2.3”項，培養至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，將仔魚轉入1.5 mL離心管中，每管80尾，在?80 ℃下貯存。加入裂解液將仔魚勻漿，離心取上清液，按照試劑盒說明書檢測各藥物組仔魚體內SOD和CAT活性。

2.5 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡的影響

采用吖啶橙（acridine orange，AO）熒光染色法檢測不同藥物質量濃度組仔魚心肌細胞凋亡情況。給藥方法同“2.3”項，培養至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，吸除胚胎水后每孔加入2 mL AO染色溶液（2.5 μg/mL），避光，放置培養箱中孵育30 min，用胚胎水清洗3次，滴入0.05%的魚安定溶液，將仔魚麻醉，轉移至含有3%甲基纖維素鈉水溶液的培養皿中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心臟發育毒性相關基因表達的影響

給藥方法同“2.3”項，培養至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，將仔魚轉入1.5 mL無酶EP管中，每個藥物組收集尾斑馬魚仔魚，在?80 ℃下貯存。使用Eastep?Super RNA提取試劑盒提取仔魚總RNA，調整總RNA濃度后，使用逆轉錄試劑盒將不同組的等量總RNA樣品逆轉錄為cDNA。設計相關基因的定量引物，引物序列見表2，作為內參，用Go Taq?qPCR Master Mix進行實時定量PCR分析相關基因的表達情況，兩步PCR擴增程序為95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，45個循環，結果采用2?ΔΔCt法計算氧化應激相關酶基因[、、谷胱甘肽S-轉移酶2（glutathione S-transferase 2，）]、心臟發育相關基因[GATA結合蛋白5（GATA binding protein 5，）、NK2同源框5（NK2 homeobox 5，）、肌球蛋白重鏈6（Myosin，heavy chain 6，）]及心肌細胞凋亡相關基因[B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）]的表達水平。

表2 引物序列

2.7 數據處理

3 結果

3.1 不同寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎心臟發育毒性劑量確定結果

根據毒性實驗中桑寄生各劑量組的斑馬魚仔魚孵化和胚胎死亡統計結果，用GraphPad Prism 8.0軟件繪制量-毒曲線，見圖1，計算不同寄主桑寄生水提物的LC10。結合預實驗結果，得到桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物的LC100、LC10和LC0。從表3可以看出，依據LC100和LC10判斷，6種寄主桑寄生的毒性大小依次為漆樹、苦楝、夾竹桃、油茶、柳樹和桑樹寄主的桑寄生。根據不同寄主桑寄生水提物的LC0和LC10，分別以其1/2LC10、LC0、LC10值設置為各寄主桑寄生水提物的低、中、高劑量組，以觀察各劑量組的心臟毒性情況。不同寄主桑寄生水提物的低、中、高質量濃度如表4所示。

圖1 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚胚胎發育毒性的量-毒曲線

表3 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚胚胎72 hpf的LC100、LC10和LC0

表4 不同寄主桑寄生水提物3個藥物質量濃度

3.2 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚仔魚心率的影響

心率是直接反映斑馬魚心臟功能是否正常的重要指標，斑馬魚仔魚在正常發育下心率約為120次/min[11]。如表5所示，空白組斑馬魚仔魚心率為（125.20±9.27）次/min，與文獻報道[11]基本一致。與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚心率均沒有明顯變化；柳樹和油茶寄主桑寄生水提物高質量濃度組仔魚心率均明顯降低（＜0.01），低、中質量濃度組仔魚心率則沒有明顯變化；苦楝、夾竹桃寄主桑寄生水提物中、高質量濃度組仔魚心率均明顯降低（＜0.01），低質量濃度組仔魚心率沒有明顯變化；漆樹寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組斑馬魚仔魚心率均明顯降低（＜0.01）。結果表明，除桑樹寄主桑寄生外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物均具有降低斑馬魚仔魚心率的作用，并表現出寄主和劑量的相關性。

3.3 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚仔魚心臟形態發育的影響

如圖2和表6所示，空白組仔魚心臟發育正常，心血管系統完好，未見心包水腫。與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚心臟未出現心包水腫現象，心包面積和SV-BA間距沒有明顯變化；柳樹和夾竹桃寄主桑寄生水提物中、高質量濃度組仔魚出現心包水腫現象，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低質量濃度組仔魚心包面積和SV-BA間距沒有明顯增大；苦楝寄主桑寄生水提物中、高質量濃度組仔魚出現心包水腫現象，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低質量濃度組仔魚SV-BA間距明顯增大（＜0.01），但心包面積沒有明顯變化；油茶和漆樹寄主桑寄生水提物高質量濃度組仔魚出現心包水腫，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低、中質量濃度組仔魚心包未出現心包水腫，心包面積和SV-BA間距沒有明顯變化。結果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育表現出不同程度的毒性，出現心包水腫、心包面積和SV-BA間距增大，其毒性具有寄主和劑量的相關性。

表5 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心率的影響 (, n = 10)

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

*0.05**0.01blank group, same as below tables

圖2 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心臟形態的影響

表6 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心包面積和SV-BA間距的影響(, n = 10)

3.4 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚仔魚SOD和CAT的影響

SOD和CAT是生物體內抗氧化防御體系中的關鍵酶。如表7所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚SOD和CAT的活性沒有明顯變化；柳樹寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚SOD活性明顯降低（＜0.05、0.01），油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物中、高質量濃度組仔魚SOD活性均顯著降低（＜0.05、0.01），但低質量濃度組仔魚SOD的活性沒有明顯降低；柳樹、油茶和漆樹寄主桑寄生中、高質量濃度組仔魚CTA活性明顯降低（＜0.01），低質量濃度組仔魚體內CAT活性沒有明顯降低；苦楝和夾竹桃寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚體內CAT活性明顯降低（＜0.05、0.01）。結果表明，除桑樹寄主桑寄生外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物使斑馬魚SOD和CAT活性降低，也表現出寄主和劑量的相關性。

表7 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚SOD和CAT活性的影響(, n = 3)

3.5 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡的影響

AO染色30 min后在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡情況，結果見圖3。空白組仔魚心肌細胞沒有觀察到片狀或點狀致密的黃綠色亮點，表明沒有存在心肌細胞凋亡。與空白組比較，桑樹、柳樹和油茶寄主桑寄生水提物低、中、高質量濃度組仔魚心肌細胞未觀察到片狀或點狀致密的黃綠色亮點；夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物的中、高質量濃度組仔魚心肌細胞觀察到片狀或點狀致密的黃綠色熒光亮點，低質量濃度組仔魚心肌細胞觀察到稀疏點狀黃綠色熒光亮點。結果表明，桑樹、柳樹、油茶寄主桑寄生水提物不會導致斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導致斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡。

圖3 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚心肌細胞凋亡的影響

3.6 不同寄主桑寄生水提物對斑馬魚胚胎心臟發育毒性相關基因表達的影響

3.6.1 對氧化應激相關基因表達的影響 如圖4所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物、、基因表達水平沒有明顯差異；柳樹、夾竹桃和漆樹寄主桑寄生水提物、、基因表達明顯下調（＜0.05、0.01）；油茶寄主桑寄生水提物、基因表達明顯下調（＜0.05、0.01），基因表達明顯上調（＜0.01）；苦楝寄主桑寄生水提物、基因表達明顯下調（＜0.01），而基因表達沒有下調。結果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導致斑馬魚出現氧化應激反應可能與、、基因表達有關，相關基因表達水平出現明顯的上調或下調，表現出具有寄主相關性。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.6.2 對心臟發育相關基因表達的影響 如圖5所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物、、基因表達沒有明顯差異；柳樹寄主桑寄生水提物基因表達明顯下調（＜0.05、0.01），、基因表達沒有明顯差異；油茶寄主桑寄生水提物基因表達明顯下調（＜0.01），、基因表達沒有明顯差異；夾竹桃寄主寄主桑寄生水提物、基因表達明顯下調（＜0.05、0.01），基因表達沒有明顯差異；苦楝寄主桑寄生水提物基因表達明顯下調（＜0.05、0.01），基因表達明顯上調（＜0.05），基因沒有明顯差異；漆樹寄主桑寄生水提物基因表達明顯下調（＜0.01），和基因沒有明顯差異。結果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導致斑馬魚胚胎心臟發育異常可能與、、基因表達有關，相關基因表達水平出現明顯的上調或下調，表現出具有寄主相關性。

圖5 不同寄主桑寄生組斑馬魚心臟發育相關基因的表達(, n = 3)

3.6.3 對心肌細胞凋亡相關基因表達的影響 如圖6所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物組、基因表達上調（＜0.05、0.01），/值沒有明顯變化；柳樹和油茶寄主桑寄生水提物、基因表達水平沒有明顯差異，/值沒有明顯差異；夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生基因表達下調（＜0.01），基因表達沒有明顯差異，/值明顯降低（＜0.05、0.01）。結果表明，除桑樹、柳樹、油茶寄主桑寄生水提物外，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物誘導斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡可能與、基因表達有關，相關基因表達水平或表達的比值出現明顯的下調或降低，表現出寄主相關性。

圖6 各寄生組斑馬魚心肌細胞凋亡相關基因的表達(, n = 3)

4 討論

心臟是斑馬魚胚胎發育過程中最早發育和發揮功能的器官，發育5 hpf后心臟祖細胞出現，22 hpf后心臟開始跳動，72 hpf后心臟發育完全[12]，且斑馬魚心臟結構與人心臟結構相似[13]。斑馬魚胚胎透明，能直接在顯微鏡下觀察到其心臟大小、形態、心率的變化，成為評價藥物心臟毒性的理想動物模型[14-15]。對于可能以安胎功效入藥使用的桑寄生而言，是否具有胚胎發育毒性，是桑寄生藥材質量控制需要解決的首要問題。對于具有復雜寄主植物來源的桑寄生，《中國藥典》2020年版通過對藥材進行強心苷的排除性檢查，即排除來自于含強心苷寄主植物的桑寄生可能造成的藥材心臟毒性。但是，除了含強心苷寄主植物的桑寄生具有心臟毒性外，其他不含強心苷的寄主植物桑寄生是否也有心臟毒性，為本研究的主要目的所在。

采用柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝、漆樹和桑樹6種寄主桑寄生對斑馬魚胚胎進行心臟發育毒性與機制研究，除夾竹桃有強心苷成分相關報道外[7-8]，其他5種寄主植物均未有任何相關研究報道。從6種寄主桑寄生的LC100和LC10可以看出，不含強心苷成分寄主（漆樹、苦楝）的桑寄生比含有強心苷成分夾竹桃寄主的桑寄生毒性強。除桑樹寄主桑寄生組斑馬魚未觀察到心臟發育毒性外，其他不含強心苷成分寄主（柳樹、油茶、苦楝和漆樹）的桑寄生與含強心苷成分夾竹桃寄主的桑寄生在處理斑馬魚胚胎后，均觀察到心包水腫、心包面積和SV-BA間距增大以及心率降低等異常現象，表現出不同程度的心臟發育毒性。提示《中國藥典》對桑寄生進行強心苷成分的排除性檢查，還不足以對有毒桑寄生的全面排除，表明規范寄主植物來源是實現桑寄生安全用藥的重要途徑。

SOD能夠清除動物體內活性自由基，CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫[16-17]。本研究檢測到除了桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主植物桑寄生處理的斑馬魚仔魚體內SOD和CAT活性均表現出不同程度的顯著降低，表明斑馬魚仔魚所受氧化損傷超出其自我修復能力，并引發明顯毒性，本研究結果與斑馬魚胚胎長時間暴露在有毒物質硝酸鉈和抗腫瘤藥物卡培他濱的環境中實驗結果一致[18-19]。

心肌細胞凋亡是藥物誘發心臟毒性的重要毒性機制[20]。進一步對6種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚仔魚的心肌細胞凋亡情況進行檢測，結果顯示，夾竹桃、苦楝和漆樹3種寄主桑寄生水提物會導致斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡，而柳樹和油茶樹寄主桑寄生水提物表現出具有心臟發育毒性，卻未觀察到斑馬魚仔魚心肌細胞凋亡，其機制值得進一步深入研究。

本研究選擇了、、、、、、、8個基因進行表達量檢測，其中、、與氧化應激有關[21]，、、與心臟發育有關[22]，、與心肌細胞凋亡有關[20]。結果顯示，除了桑樹寄主桑寄生藥材外，其他5種寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎，上述8種基因出現不同程度的表達水平異常，其中，與氧化應激有關的基因、、在柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹5種寄主桑寄生處理的斑馬魚胚胎中表達異常，出現明顯的上調或下調，與這5種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎SOD和CAT活性降低、心包水腫和心率降低等結果一致，表明這5種寄主桑寄生心臟毒性可能與藥材造成的氧化應激反應有關。與心臟發育有關的基因、、在5種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎中也出現明顯的上調或下調，這5種寄主桑寄生可能會影響斑馬魚的心臟發育。與心肌細胞凋亡有關的基因、在6種寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎中，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎基因表達明顯下調，/值明顯降低，而桑樹、柳樹和油茶樹桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎相關基因的表達則沒有表現出同樣的變化，心肌細胞凋亡相關基因的表達結果與實驗觀察到的心肌細胞凋亡現象結果一致。

綜上所述，桑寄生心臟發育毒性具有寄主相關性，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現出不同程度的心臟發育毒性，其中，柳樹和油茶寄主桑寄生的心臟發育毒性可能與氧化應激反應、心臟發育異常有關，而夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生的心臟發育毒性則可能與氧化應激反應、心臟發育異常、心肌細胞凋亡有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cardiac developmental toxicity and mechanism of aqueous extracts offrom different hosts in zebrafish embryo

LIU Jia-li1, 2, XIA Yu-ping1, CHEN Liu-yan1, LIU Shu-ning1, LI Jian-hua3, RU Mei1, LI Yong-hua1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Nanning 530200, China 3. Guangxi Wuzhou Shennong LiangpinAgricultural Technology Co., LTd., Wuzhou 543213, China

To study the cardiac developmental toxicity and mechanism of aqueous extracts of Sangjisheng () from different hosts in zebrafish embryo, and provide theoretical basis for drug safety of.The normally developed zebrafish embryos at 6 h post fertilization (6 hpf) was used as the animal model. Zebrafish embryos were treated with low-, medium-, high-concentrations of aqueous extracts offrom(mulberry, THM),(willow, THW),(THC),(oleander, THO),(neem, THN) and(hoggum, THH). Then, heart morphology, heart rate, pericardial area, and sinus venosus-bulbus arteriosus (SV-BA) spacing length, activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and cardiomyocytes apoptosis of zebrafish at 72 hpf were observed and measured. The expression levels of oxidative stress-related genes [,, glutathione S-transferase 2 ()], cardiac development-related genes [GATA binding protein 5(), NK2 homeobox 5(), myosin heavy chain 6 ()] and cardiomyocyte apoptosis-related genes [B-cell lymphoma-2 (), Bcl-2-related X protein ()] were detected.Compared with control group, except for the zebrafish of THM, the other five groups all presented pericardial edema, decreased heart rate, increased SV-BA in varying degrees (< 0.05, 0.01), activities of SOD and CAT were all reduced (< 0.05, 0.01),,,,andexpression levels were significantly up- or down-regulated (< 0.05, 0.01)Cardiomyocytes appeared apoptosis in the groups of THO, THN and THH,expression and/were also significantly decreased (< 0.05, 0.01).Cardiac developmental toxicity ofto zebrafish embryos is obviously host-dependent. Except for THM, the others all show varying degrees of cardiac developmental toxicity. The toxicity mechanism is also dependent on the host plants.

; host; zebrafish; cardiac developmental toxicity; oxidative stress; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0160 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.019

2022-10-10

國家自然科學基金資助項目（82160754）；國家自然科學基金資助項目（81960722）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD19245087）；中藥學廣西一流學科建設項目（桂教科研[2022]1號）；中藥學廣西一流學科建設項目（2018XK027，2019XK091，2019XK097）；廣西研究生教育創新計劃資助項目（JGY2020102）；廣西食品安全地方標準制定計劃項目（2022007）

劉佳莉（1998—），碩士研究生，研究方向為中藥質量控制與中藥資源開發。E-mail: 2360535705@qq.com

通信作者：李永華（1964—），博士，研究員，研究方向為中藥質量控制與中藥資源開發。E-mail: liyonghua185@126.com

汝 梅（1987—），博士，講師，研究方向為藥用植物資源與開發。E-mail: rumei2015@163.com

[責任編輯 李亞楠]