馬錢內生真菌Exserohilum rostratum次生代謝產物研究

易 誠，曹海燕，陳科良，楊晨宇，劉云寶

馬錢內生真菌Exserohilum rostratum次生代謝產物研究

易 誠，曹海燕，陳科良，楊晨宇，劉云寶*

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥物研究所 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050

對有毒植物馬錢內生真菌的次生代謝產物進行研究。通過硅膠柱色譜及反相HPLC等多種色譜分離方法進行分離純化，運用高分辨質譜、核磁共振波譜、紅外、紫外及圓二色譜等分析方法對所分離的化合物進行結構鑒定。采用Griess法對化合物進行抗炎活性測試。從有毒植物馬錢內生真菌的發酵產物中分離得到6個化合物，分別鑒定為exserone A（1）、(3,4)-4,8-二羥基-3-[()-2-羥基戊基]-6,7-二甲氧基異色滿-1-酮（2）、(＋)-monocerin（3）、11-hydroxymonocerin（4）、5-丁基-6-(羥甲基)-4-甲氧基-2-吡喃酮（5）和setophapyrone B（6）。化合物1為新的聚酮類化合物，命名為突蠕孢酮。化合物3具有潛在的抗炎活性。

馬錢；內生真菌；次生代謝產物；抗炎；突蠕孢酮；(＋)-monocerin；5-丁基-6-(羥甲基)-4-甲氧基-2-吡喃酮

植物內生真菌廣泛存在于健康植物的各種組織和器官內部。在長期的與宿主植物協同進化過程中，內生真菌會產生結構多樣和生物活性良好的次生代謝產物[1-3]。馬錢科植物馬錢L是一種喬木植物，全株均有毒性，廣泛分布于南亞及東南亞地區，在我國云南、廣東及海南等地有引種栽培，其種子馬錢子為我國傳統中藥，始載于《本草綱目》，性寒味苦，歸肝、脾經，具有通絡止痛、散結消腫的功效。現代研究表明，馬錢種子、根皮、莖皮和葉中均含有吲哚類生物堿，其中主要有毒成分是士的寧和馬錢子堿[4-6]。馬錢植株體內特征性的活性成分，為其內生真菌提供了獨特的生長環境，然而尚未有對其內生真菌次生代謝產物的報道。本研究針對新鮮馬錢葉片進行內生真菌分離，獲得一株突臍蠕孢屬真菌。國內外研究者從該屬真菌的次生代謝產物中發現了一系列具有抗菌活性的聚酮及生物堿類化合物[7-8]。本研究對該株真菌的次生代謝產物進行了系統研究，從其95%乙醇提取物中分離鑒定了6個聚酮類化合物（圖1），分別鑒定為exserone A（1）、(3,4)-4,8-二羥基-3-[()-2-羥基戊基]-6,7-二甲氧基異色滿-1-酮（(3,4)-4,8-dihydroxy-3-[()-2-hydroxypentyl]- 6,7-dimetho-xyisochroman-1-one，2）、(＋)-monocerin（3）、11-hydroxymonocerin（4）、5-丁基-6-(羥甲基)-4-甲氧基-2-吡喃酮[5-butyl-6-(hydroxymethyl)-4- methoxy-2-pyran-2-one，5] 和setophapyrone B（6）。其中化合物1為新化合物，命名為突蠕孢酮。

圖1 化合物1～6的結構

1 儀器與材料

安捷倫6205 Q-TOF高分辨質譜儀；Nicolet 5700 FT-IR紅外光譜儀；Rudolph Autopol V旋光儀；JASCO J-810圓二色譜儀；安捷倫DD2-500或布魯克 AVⅢHD-600及700核磁共振光譜儀；安捷倫HP1100型高效液相色譜儀；島津LC-6AD 制備液相，SPD-20A紫外檢測器；OSB-2200型旋轉蒸發儀（日本EYELA公司）；Sartorious GL124-1SCN型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；YMC-Pack ODS-A型（250 mm×10 mm，5μm）半制備柱；大賽璐 CHIRAPAK AD-H型（250 mm×10 mm，5μm）半制備柱；硅膠（200～300目）、硅膠GF254預制板（青島海洋化工集團公司）；色譜甲醇、色譜乙腈（Mreda公司）；姜黃素（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號c12811019）；其他試劑若無特別說明的均購于北京通廣精細化工公司，級別為分析純。

2 方法

2.1 菌種來源

新鮮的馬錢葉片采自廣西省，葉片經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為馬錢科植物馬錢L.，樣品標本（S2506）現保存于北京協和學院藥物研究所植物標本室。

菌株12-1-2是從馬錢L.健康葉片中分離獲得的一株內生真菌。根據形態學特征以及ITS序列同源對比鑒定該菌株為突臍蠕孢屬真菌。該菌株現保存于中國醫學科學院、北京協和醫學院藥物研究所劉云寶課題組。

2.2 提取和分離

將菌種轉接至PDA培養基中，28 ℃下培養5 d，再將其接種于PDB培養基中于28 ℃下培養、7 d作為種子液。將其轉接于1 L的三角燒瓶中（每瓶中含100 g大米、100 mL水；高壓蒸汽滅菌15 min，共3瓶），置于室溫下培養30 d。室溫下用3倍量95%乙醇對發酵好的菌絲體超聲提取3次，每次30 min，濾過后進行減壓濃縮，回收溶劑至無醇味，共得到20.1 g浸膏。將所得浸膏用5倍量水分散，經醋酸乙酯反復萃取3次，得到醋酸乙酯部位粗膏3.7 g。采用硅膠色譜柱對醋酸乙酯部位樣品進行分離，以二氯甲烷-甲醇（200∶1、150∶1、100∶1、75∶1、50∶1、25∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1）作為洗脫劑進行梯度洗脫得12個流分（每個洗脫體積1000 mL），以薄層色譜進行檢識，合并流分得到8個不同極性組分（Fr. 1～8）。Fr. 6（930.3 mg）經制備液相色譜（C18半制備柱，流動相45%乙腈-55%水）純化，得到化合物1（R＝17.6 min，1.5 mg）和2（R＝30.5 min，643.3 mg）。Fr. 7（140.8 mg）經制備液相色譜（C18半制備柱，流動相30%乙腈-70%水）分離，得到化合物3（R＝21.2，4.2 mg）。Fr. 8（180.6 mg）經制備液相色譜（C18半制備柱，流動相20%乙腈-80%水）分離，得到化合物4（R＝53.4 min，1.3 mg）、5（R＝64.3 min，5.4 mg）和6（R＝74.4 min，10.4 mg）。

2.3 體外抗炎活性測試

根據文獻報道方法[9]進行體外抗炎活性測試，首先細胞按2×105/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，貼壁4 h后，加入50 μL的10 μmol/L的目標化合物（對照孔或模型孔中加入等體積的培養基）孵育2 h，再加入50 μL終質量濃度為10 g/L的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導（對照孔中加入等體積培養基）24 h，Griess法測定上清中NO2?的含量，用以反映NO水平。姜黃素（終濃度為200 μmol/L）作為陽性對照藥物。

3 結果

3.1 結構鑒定

表1 化合物1的1H- 及13C-NMR數據(700/175 MHz Methanol-d4)

根據高分辨質譜，確定化合物1的分子式為C16H20O7，含有7個不飽和度。化合物1的IR譜顯示化合物1的結構中存在羥基（3 362.3 cm?1）、羰基（1 715.1 cm?1）和苯環（1 668.6 cm?1）。1H-NMR和13C-NMR數據顯示化合物1含有1個酮羰基，1個酯羰基，6個芳香碳，2個連氧次甲基，3個亞甲基，2個甲氧基，1個甲基（表1）；1H-NMR數據H6.71 (1H, s) 和13C-NMR數據C137.6, 104.5, 160.3, 139.0, 156.8, 102.9 表明化合物1中存在1個五取代的苯環；結合13C-NMR和HSQC譜分析可知，碳譜中共有16個碳信號，包括1組五取代苯碳信號C160.3 (C-6), 156.8 (C-8), 139.0 (C-7), 137.6 (C-4a), 104.5 (C-5), 102.9 (C-8a)；1個酯碳基碳信號C170.4 (C-1)；1個羰基碳信號C209.5 (C-10)；1個甲基碳信號C14.0 (C-13)；3個亞甲基碳信號C43.7 (C-9), 46.1 (C-11), 18.0 (C-12)；2個次甲基碳信號C79.4 (C-3), 66.6 (C-4)。結合上述數據推斷該化合物為monocerin[11]類衍生物；由1H-1H COSY和HSQC圖譜可推斷結構中含有α（H2-11/H2-12/H3-13）和β（H-4/H-3/H2-9）2個自旋系統（圖2）；由H-3與C-1/C-4/C-4a以及H-5與C-1的HMBC相關信號推測結構中的吡喃酮環和苯環通過C-4a和C-8a駢合。根據已鑒定的2個自旋系統α和β，以及H2-9、H2-11、H2-12和C-10的HMBC信號，確定了C-9/C-3的結構片段；通過H2-9和C-3、C-4的HMBC信號，確定C-9/C-13片段通過C-3與吡喃酮環連接；通過6-OCH3和C-6、7-OCH3和C-7的HMBC信號與6-OCH3和H-5的NOE效應分別確定了2個甲氧基的連接位置（圖3）。因此，化合物1的平面結構鑒定為4,8-dihydroxy-6,7-dimethoxy-3-(2-oxopentyl) isochroman-1-one。通過H-3和H-4的偶合常數（= 2.2 Hz）可以確定H-3和H-4的相對構型為[10]。化合物1的絕對構型通過計算ECD確定，將化合物1的其中一種構型(3,4) 的計算ECD譜圖與實驗測得的CD譜圖相比對，兩者具有一致的Cotton效應（圖4）。因此，化合物1的結構確定為 (3,4)-4,8-二羥基-6,7-二甲氧基-3-(2-氧代戊基) 異色滿-1-酮，命名為突蠕孢酮。

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關信號

圖3 化合物1的主要ROESY相關信號

圖4 化合物1的實驗ECD譜圖及其計算ECD譜圖

化合物2：無色油狀物。[α]20 D?8.62（0.25，CH3OH）。HR-ESI-MS327.143 6 [M＋H]+（計算值C16H23O7，327.143 8）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 11.05 (1H, s, 8-OH), 6.56 (1H, s, H-5), 4.73 (1H, ddd,= 8.0, 5.4, 2.2 Hz, H-3), 4.65 (1H, m, H-4), 3.97 (1H, m, H-10), 3.93 (3H, s, 6-OCH3), 3.87 (3H, s, 7-OCH3), 3.13 (1H, d,= 6.0 Hz, 4-OH), 2.59 (1H, d,= 2.3 Hz, 10-OH), 2.16 (1H, ddd,= 14.6, 8.3, 1.9 Hz, H-9β), 1.86 (m, 1H, H-9α), 1.54 (2H, m, H-11), 1.47 (1H, m, H-12β), 1.39 (1H, dddd,= 15.7, 10.5, 7.3, 5.2 Hz, H-12α), 0.95 (3H, t,= 7.1 Hz, H-13)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 169.0 (C, C-1), 158.9 (C, C-8), 156.1(C, C-6), 136.8 (C, C-7), 136.6 (C, C-4a), 102.9 (CH, C-5), 102.0 (C, C-8a), 79.6 (CH, C-3), 67.8 (CH, C-10), 67.0 (CH, C-4), 60.9 (CH3, 7-OCH3), 56.4 (CH3, 6-OCH3), 40.6 (CH2, C-9), 37.7 (CH2, C-11), 18.8 (CH2, C-12), 14.1 (CH3, C-13)。以上數據與文獻報道數據基本一致[10]，確定化合物2為(3,4)-4,8-dihydroxy-3-[()-2-hydroxypentyl]- 6,7-dimethoxyisochroman-1-one。

化合物3：無色油狀物。[α]20 D＋43.25（0.25, MeOH）。HR-ESI-MS309.132 2 [M＋H]+（計算值C16H21O6，309.133 2）。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6.75 (1H, s, H-5), 5.05 (1H, m, H-3), 4.60 (1H, d,= 2.9 Hz, H-4), 4.10 (1H, ddt,= 8.7, 7.2, 5.6 Hz, H-10), 3.92 (3H, s, 6-OCH3), 3.79 (3H, s, 7-OCH3), 2.62 (1H, ddd,= 14.6, 8.7, 6.0 Hz, H-9β), 2.01 (1H, ddd,= 14.4, 5.6, 1.0 Hz, H-9α), 1.55 (2H, m, H-11), 1.35 (2H, m, H-12), 0.89 (3H, t,= 7.3 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 169.5 (C, C-1), 160.2 (C, C-6), 156.9 (C, C-8), 138.1 (C, C-7), 133.4 (C, C-4a), 106.1 (CH, C-5), 103.0 (C, C-8a), 83.1 (CH, C-3), 79.8 (CH, C-10), 75.7 (CH, C-4), 61.0 (CH3, 7-OCH3), 56.9 (CH3, 6-OCH3), 40.0 (CH2, C-9), 39.5 (CH2, C-11), 20.2 (CH2, C-12), 14.3 (CH3, C-13)。以上數據與文獻數據基本一致[11]，確定化合物3為(＋)-monocerin。

化合物4：無色油狀物。[α]20 D＋26.45（0.05，CH3OH）。HR-ESI-MS/325.128 1 [M＋H]+（計算值C16H21O7，325.128 1）。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 11.31 (1H, s, 8-OH), 6.62 (1H, s, H-5), 5.12 (1H, ddd,= 6.0, 3.3, 1.7 Hz, H-3), 4.62 (1H, d,= 3.3 Hz, H-4), 4.10 (1H, m, H-10), 3.98 (3H, s, 6-OCH3), 3.93 (3H, s, 7-OCH3), 3.74 (1H, dq,= 8.0, 4.0 Hz, H-11), 2.52 (2H, m, H-9), 1.80 (1H, d,= 3.5 Hz, 11-OH), 1.55 (1H, m, H-12β), 1.45 (1H, ddq,= 14.5, 8.6, 7.4 Hz, H-12α), 1.01 (3H, t,= 7.4 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 167.6 (C, C-1), 158.8 (C, C-6), 156.3 (C, C-8), 137.4 (C, C-7), 130.6 (C, C-4a), 104.3 (CH, C-5), 102.1 (C, C-8a), 81.5 (CH, C-3), 80.7 (CH, C-10), 74.6 (CH, C-4), 73.0 (CH, C-11), 60.8 (CH3, 7-OCH3), 56.3 (CH3, 6-OCH3), 33.8 (CH2, C-9), 26.0 (CH2, C-12), 10.1 (CH3, C-13)。以上數據與文獻數據基本一致[12]，確定化合物4為exserolide E。

化合物5：棕色無定形粉末。HR-ESI-MS/213.112 1 [M＋H]+（計算值C11H17O4，213.112 1）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.63 (1H, s, H-3), 4.37 (2H, d,= 1.2 Hz, H-11), 3.88 (3H, s, 4-OCH3), 2.43 (2H, dd,= 8.6, 6.9 Hz, H-7), 1.42 (2H, m, H-8), 1.35 (2H, m, H-9), 0.92 (3H, t,= 7.3 Hz, H-10)；13C- NMR (150 MHz, CD3OD): 173.0 (C, C-4), 166.9 (C, C-2), 160.0 (C, C-6), 115.1 (C, C-5), 89.9 (CH, C-3), 59.2 (CH2, C-11), 57.3 (CH3, 4-OCH3), 33.3 (CH2, C-8), 24.2 (CH2, C-7), 23.6 (CH2, C-9), 14.2 (CH3, C-10)。以上數據與文獻數據基本一致[13]，確定化合物5為5-butyl-6-(hydroxymethyl)-4-methoxy-2- pyran-2-one。

化合物6：棕色無定形粉末。[α]20 D＋2.28（0.05，CH3OH）。經手性柱色譜分析，確定化合物6為一對對映異構體。拆分后，分別測得旋光值為：9-(+)-setosphapyrone B（5.4 mg）：[α]20 D＋7.2 (0.05, MeOH)；9-(?)-setosphapyrone B（3.9 mg）：[α]20 D?9.6 (0.05, MeOH)。HR-ESI-MS/213.112 0 [M＋H]+（計算值C11H17O4，213.112 1）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.56 (1H, s, H-3), 3.87 (3H, s, 4-OCH3), 3.70 (1H, ddd,= 7.8, 6.2, 4.6 Hz, H-9), 2.52 (1H, ddd,= 13.9, 10.1, 5.6 Hz, H-7β), 2.40 (1H, ddd,= 13.9, 10.0, 6.4 Hz, H-7α), 2.26 (3H, s, H-11), 1.51 (2H, m, H-8), 1.17 (3H, d,= 6.2 Hz, H-10)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 173.3 (C, C-4), 167.4 (C, C-2), 159.9 (C, C-6), 113.3 (C, C-5), 88.4 (CH, C-3), 68.0 (CH, C-9), 57.1 (CH3, 4-OCH3), 39.1 (C, C-8), 23.6 (CH3, C-10), 21.6 (CH2, C-7), 17.1 (CH3, C-11)。以上數據與文獻數據比對基本一致[14]，確定化合物6為setophapyrone B。

3.2 藥理活性

對上述6個化合物進行體外抗炎活性測試，顯示化合物3在10 μmol/L的濃度下，對LPS誘導的RAW 264.7細胞的NO生成抑制率為66.9%。其余各化合物均無顯著抑制作用，抑制率均低于5%。

4 討論

近年來，植物內生真菌研究已成為天然產物領域的一大熱點，國內外研究者已從植物內生真菌中發現了一系列活性良好[15-17]、骨架新穎[18-19]的次生代謝產物。本研究綜合利用多種分離技術從有毒植物馬錢內生真菌中分離鑒定了6個聚酮類化合物，其中1為新化合物。活性測定結果表明化合物3具有一定抗炎活性。以上研究結果在一定程度上豐富了植物內生真菌次生代謝產物的化學結構和活性的多樣性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Investigation on secondary metabolites of endophytic fungushosted in

YI Cheng, CAO Hai-yan, CHEN Ke-liang, YANG Chen-yu, LIU Yun-bao

State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To study secondary metabolites of endophytic fungushosted ineparation and purification were carried out by various chromatographic separation methods such as silica gel column chromatography and HPLC.The structures of the isolated compounds were identified byHR-ESI-MSNMR,IR, UV, and ECDThe compounds were tested for their anti-inflammatory activity by the Griess method.Six compounds, exserone A (1), (3,4)-4,8-dihydroxy-3-(()-2-hydroxypentyl)-6,7-dimetho-xyisochroman-1-one (2), (＋)-monocerin (3), 11-hydroxymonocerin (4), 5-butyl-6-(hydroxymethyl)-4-methoxy-2-pyran-2-one (5) and setophapyrone B (6), were isolated from the fermentation products of endophytic fungus.Compound 1 is a new polyketide and named exserone A. Compound 3 has potential anti-inflammatory activity.

L; endophytic fungus; secondary metabolites; anti-inflammation; exserone A; (＋)-monocerin; 5-butyl-6-(hydroxymethyl)-4-methoxy-2-pyran-2-one

R284.1

A

0253 - 2670(2023)01 - 0035 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.005

2022-10-11

中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程項目（CIFMS-2022-I2M-JB-009）

易 誠，中國醫學科學院藥物研究所碩士研究生。E-mail: yicheng@imm.ac.cn

通信作者：劉云寶，博士，研究員，研究方向為特殊生境微生物中新穎結構活性分子的發現及其形成機制研究。Tel: (010)83162679 E-mail: liuyunbao@imm.ac.cn

[責任編輯 王文倩]