紅花不同花色變異類型葉綠體基因組特征與系統進化分析

丁怡寧，畢光耀，胡賽文，周 艷，李賀敏，夏 至

紅花不同花色變異類型葉綠體基因組特征與系統進化分析

丁怡寧，畢光耀，胡賽文，周 艷，李賀敏*，夏 至*

河南農業大學農學院，河南 鄭州 450046

以紅花不同花色變異類型為材料，比較分析其葉綠體基因組結構及其與近緣類群的系統發育關系，為中藥材紅花種質資源鑒定和群體遺傳學研究奠定基礎。利用華大MGISEQ-2000PE150測序平臺，雙末端測序策略對紅花不同花色類型全基因組DNA建庫測序，用NOVOPlasty組裝葉綠體基因組，采用最大似然法（maximum Likelihood，ML）構建系統進化樹。紅花3種花色變異類型葉綠體基因組全長均為153 114 bp，完全一致，GC值均為37.8%，具1個典型的四分區域結構，包括1個大單拷貝區（large single copy region，LSC）、1對反向重復區（inverted repeats，IR）和1個短單拷貝區（small single copy，SSC），4個區序列長度分別為84 128、25 194、18 598 bp。紅花的葉綠體基因組均有130個基因，其中編碼蛋白基因、rRNA基因與tRNA基因的數量均為84、8、38個。系統進化分析表明，紅花3種花色變異類型聚在一支，與菜薊族的鋪散矢車菊構成一單系分支，具有100%支持率。葉綠體基因組數據支持紅花3種花色變異類型來源為同一種，藥用植物紅花（所在紅花屬）隸屬于菊科菜薊族的矢車菊亞族。

紅花；葉綠體基因組；組裝；系統發育；近緣類群

藥用植物紅花L.，隸屬于菊科（Asteraceae）紅花屬L.，為一年生草本[1]。紅花原產中亞地區，引種后在我國廣為栽培，以河南和新疆栽培面積大，所產紅花質量好。《中國藥典》2020年版規定紅花有效成分為羥基紅花黃色素A[2]。近年來，化學成分研究表明紅花主要含黃酮類物質、脂肪酸、色素、酚酸、揮發油等多種活性成分[3]，具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等藥理作用，臨床應用十分廣泛[4]。藥用植物紅花在栽培過程中，常出現花色分化現象，除常見的橙紅色花，還有部分淺黃色和白色花。這些花色變異的類型是種內變異還是來源于同屬不同物種，需要進一步的形態和分子驗證。目前，藥用植物紅花的葉綠體基因組雖然已經報道[5]，但是對于紅花不同花色變異類型的葉綠體基因組組裝、基因組特征和系統進化分析等未見報道。

葉綠體是植物最重要的細胞器之一，具有一整套用于光合作用、能量代謝、蛋白質合成及氮、硫同化相關的基因，分布在大小為120～180 kb的環狀基因組上，具有結構保守，母性遺傳等特點[6-7]。葉綠體基因組一般為閉環雙鏈DNA結構，陸生植物的葉綠體基因組結構通常由1個大單拷貝區域（large single copy，LSC）、1個短單拷貝區域（small single copy，SSC）和2個反向重復區域（inverted repeat，IR）組成[8]。葉綠體基因組擁有相對獨立的基因組和遺傳序列，并且不像核基因組一般有著復雜的重復序列，其基因序列保守，間隔區變異位點豐富，適宜的進化速率能夠為植物不同等級的親緣關系[9]，系統進化關系及遺傳多樣性研究提供較為可靠的信息[10]。

近年來，葉綠體全基因組測序研究的快速發展為藥用植物的分子鑒定研究提供了新的平臺及思路[11]。隨著測序技術的不斷改進，測序平臺的不斷升級，一系列組裝和注釋軟件如plasmid SPAdes[12]、NOVOPlasty[13]、GetOrganelle[14]等的開發與更新，多種重要的藥用植物葉綠體基因組已完成測序和分析，如人參C. A. Meyer[15]、厚樸(Rehder & E. H. Wilson) N. H. Xia & C. Y. Wu[16]、紅豆杉(Pilger) Florin[17]、肉蓯蓉Ma[18]、三七(Burkill) F. H. Chen ex C. Chow & W. G. Huang[19]、野菊Linnaeus[20]、石斛Lindl.[21]、地黃(Gaert.) Libosch. ex Fisch. et Mey[22]、射干(L.) Redouté[23]等的葉綠體全基因組序列的分析已有相關報道。本研究以紅花不同花色變異類型為材料，利用高通量測序方法測定其基因組DNA序列，并對該植物的葉綠體基因組進行組裝和注釋。分析藥用植物紅花3種花色類型葉綠體基因組序列特征，IR邊界特征，間隔區信息位點的特征，并對紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）植物的葉綠體基因組序列進行系統發育分析，驗證其在科級系統發育中的位置，為藥用植物紅花的種質資源的鑒定、開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料

紅花L. 3種顏色（橙紅色、淺黃色、白色）的新鮮葉片釆集于河南省新鄉市原陽縣小吳莊村河南農業大學科教園區（35°6′32″N，113°56′34″E），憑證標本號分別為XZ-2020-30、XZ-2020-29、XZ-2020-28。葉片裝入取樣袋后帶回實驗室，用無菌水沖洗數次，晾干后置于?80 ℃冰箱備用。樣品由河南農業大學農學院中藥材系高致明教授和夏至副教授鑒定為菊科紅花屬的紅花。憑證標本保存于河南農業大學標本館，紅花及其近緣物種葉綠體基因組序列來源于NCBI數據庫，實驗材料詳細信息見表1。

2 方法

2.1 DNA的提取和高通量測序

采用北京天根生化植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，中國）提取樣品紅花新鮮葉片的總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。樣品送至華大生物科技公司（北京）后，進行NanoDrop2000微量分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測總DNA的純度和濃度。MGISEQ-2000 PE150測序平臺測序，測序完成后，利用華大自主開發的過濾軟件SOAPnuke過濾參數，過濾步驟：（1）過濾接頭：測序read匹配上adapter序列的25%或者以上則刪除整條read；（2）過濾低質量數據：如果測序read中質量值低于20的堿基占整條read的30%或者以上則刪除整條read；（3）去N：如果測序read中N含量占整條read的1%或者以上，則刪除整條read；（4）獲得Clean reads。數據以FASTQ格式儲存，用于后續的拼接和注釋。

2.2 葉綠體基因組的拼接和注釋

葉綠體基因組拼接釆用NOVOPlasty[13]程序，插入片段大小設為150 bp。過濾后的reads用Geneious 11.0.3[24]拼接軟件組裝成重疊群，并對組裝中的簡并堿基，進行人工修正。利用Geneq-Annotation of Organellar（https://chlorobox.mpimpgolm.mpg.de/ geseq.html），結合NCBI上已報道的紅花（GenBank登錄號：KM207677）注釋結果對紅花的3個樣品葉綠體全基因組進行基因注釋，參數為默認值，最后進行手動調整。tRNA用ANAGORNV1.2.38（https:// chlorobox. mpimp golm.mpg.de/geseq.html）預測。注釋完成后，提交到NCBI數據庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/ genbank/），GenBank登錄號分別為MZ779040（橙紅色，XZ2130），MZ779039（淺黃色，XZ2129），MZ779038（白色，XZ2128）。利用在線工具OGDRAW-DRAW Organelle Genome Maps（https: //chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw. html）繪制葉綠體結構圖。

表1 植物樣品來源

2.3 葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴張分析

IR區域在葉綠體基因中具有高度保守性，IR邊界的膨脹和收縮被認為是被子植物葉綠體全基因組大小變化的主要機制[25]。在植物進化過程中，IR/SC邊界不同程度的擴張和收縮是導致邊界和基因組長度多樣性的原因[26]。本研究使用Geneious 11.0.3[22]軟件獲得紅花及菊科其他11種植物葉綠體基因組的IRA/IRB、LSC和SSC和邊界基因的序列長度，進行比較分析，探討菊科植物葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴張特征。并使用Adobe illustrator軟件繪制菊科管狀花亞科12個屬植物葉綠體基因組IR邊界對比圖。

2.4 葉綠體基因組基因間隔區信息位點分析

相比葉綠體基因編碼區，葉綠體基因間隔區在近緣物種間往往具有更高的變異位點，常被用來構建屬間、屬內、種間物種系統進化發育關系[27]。本研究基于紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）植物的葉綠體基因組序列特征，利用Phylosuite vl.2.1[28]提取紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）植物的葉綠體基因組共有的間隔區。統計這些間隔區的信息位點百分率，為下一步構建菊科屬級和屬內種間物種系統進化關系提供分子標記。

2.5 系統發育分析

基于菊科（Asteraceae）管狀花亞科（Carduoideae）紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）葉綠體基因組數據（表1），同時以菊科（Asteraceae）舌狀花亞科（Cichorioideae）假還陽參和蒲公英為外類群，利用phylosuite vl.2.1[26]軟件基于MAFFT[29]進行多重比對。系統發育分析采用最大似然法（maximum Likelihood，ML），利用CIPRES Science Gateway服務器（http://www. phylo.org/）中RaxML-HPC2 8.2.12軟件[30]，采用GTR+GAMMA+I建樹模型，構建系統發育樹。利用Bootstrap（BS）（1000次重復）檢驗各分支的支持率。

3 結果與分析

3.1 紅花3種花色類型的葉綠體基因組結構特征

橙紅色、淺黃色、白色這3種花色的紅花，花期一致，植株形態無明顯差異，隨花期的變化，其顏色一直保持穩定，并且花色差異明顯（圖1）。測序結果去除接頭和低質量的數據，組裝和注釋后得到橙紅色、淺黃色、白色紅花的葉綠體基因組。結果表明，紅花3種花色類型的葉綠體全基因組均為共價閉合的雙鏈環狀分子（圖2），全長均為153 114 bp，是一個典型的4分區域結構，包括1個大單拷貝區（LSC）、1對反向重復區（IR）和1個短單拷貝區（SSC），紅花3種花色類型的4個區長度均相等，序列長度分別為84 128、25 194、18 598 bp。3種花色的紅花在LSC區域、SSC區域和IRs區中GC含量也完全一致，分別為36.0%、31.4%、43.2%。

圖1 紅花（3種花色）不同開花時期的花瓣

3.2 紅花3種花色類型葉綠體基因組的組成和特點分析

紅花3種花色類型的葉綠體基因組完全一致，均包括130個基因，非重復基因115個，其中84個編碼蛋白基因（PCG）、8個rRNA基因與38個tRNA基因。其中，蛋白質編碼基因中與自我復制相關基因除rRNA基因和tRNA基因外，還包括13個核糖體小亞基基因、11個核糖體大亞基基因和4個RNA聚合酶亞基基因；光合作用相關的基因有44個，包括12個NADH脫氫酶基因、5個光合系統I基因、14個光合系統II基因、6個細胞色素復合物編碼基因、6個ATP合酶基因、1個二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因；此外還有5個其他功能基因及7個未知功能基因（表2）。在tRNA中trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-、trnN-GUU、trnR-ACG和trnV-GAC各有2個拷貝，trnF-GAA有3個拷貝；4個核糖體RNA（rrn5 rRNA、rrn4.5 rRNA、rrn23 rRNA、rrn16 rRNA）均有2個拷貝，分別位于反向重復區IRA和IRB。核糖體蛋白大小亞基編碼的基因中，和這2個基因均有2個拷貝，其余為1個拷貝。NADH脫氫酶亞基中的基因及未知功能蛋白基因和的拷貝數均為2。紅花葉綠體基因組中有21個基因有內含子。其中，trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、rps16、rpl2、rpl16、rpl23、rpoC1、ndhA、ndhB、petB、petD和atpF各有1個內含子，而rps12、clpP、ycf3具2個內含子。matK基因位于tmK-UUU基因內，整個編碼區為trnK-UUU內含子的一部分，存在序列共用現象。

LSC和SSC：大單拷貝區域、小單拷貝區域；IRA和IRB：2個反向重復區域；內圈深色部分：GC含量

表2 紅花葉綠體基因組編碼的基因

a和b分別表示含有1個和2個內含子 c-含有2個拷貝基因 d-含有3個拷貝基因

a and b represent 1 and 2 introns respectively, c-contains 2 copy genes, d contains 3 copy genes

3.3 菊科部分物種葉綠體全基因組特征比較分析

菊科植物葉綠體基因組特征的比較分析見表3，紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）植物葉綠體基因組的序列長度范圍為150 063～153 318 bp，其中下田菊的葉綠體全基因組長度最短（150 063 bp），鉆葉紫菀的葉綠體基因組最長（153 318 bp）。不同花色的紅花葉綠體基因組全長完全相同，均為153 114 bp，介于菊科18個物種的葉綠體基因組長度范圍之內。紅花及其17種近緣植物葉綠體基因組GC含量的范圍為37.0%～37.8%，鉆葉紫菀的GC含量最低（37.0%），不同花色的紅花GC值完全相同，且含量最高（37.8%）。

利用Geneious 11.0.3軟件獲取紅花及17種近緣菊科植物的IR區、LSC區和SSC區序列。結果表明，IR區的序列長度范圍為23 776～25 238 bp，其中假臭草的IR區最短（23 776 bp），鋪散矢車菊的IR區最長（25 238 bp），不同花色的紅花IR區的長度完全一致均為25 194 bp，介于菊科21個樣品IR區長度范圍之內。LSC區序列長度范圍為82 017～94 697 bp，其中下田菊的LSC區長度最短（82 017 bp），紫菀的LSC區長度最長（94 697 bp），不同花色的紅花LSC區的長度完全一致均為84 128 bp，介于菊科18個物種LSC區長度范圍之內。SSC區序列長度范圍介于17 949～18 598 bp，其中豚草的SSC區最短（17 949 bp），不同花色的紅花SSC區的長度完全一致且最長（18 598 bp）。

表3 菊科植物18種（21個樣品）的葉綠體基因組特征

3.4 紅花及菊科11種植物的葉綠體全基因組邊界的特征

紅花及本研究選取的管狀花亞科11個屬共12種植物葉綠體基因組的IR-LSC和IR-SSC邊界比較顯示（圖3），不同花色的紅花，其邊界具有高度的保守性，各邊界側翼基因完全相同，擴張程度也完全一致。紅花與其余11種菊科植物葉綠體全基因組相比，邊界處具有相同的基因，但是基因的長度仍有差異，部分邊界基因也存在變化。LSC/IRb邊界（JLB）邊界擴張范圍顯示，紅花與其余11種菊科植物相比，JLB邊界均位于rps19基因內，但擴張程度稍有差異，紅花rps19基因向LSC區域擴張220 bp，向IRb擴張59 bp。SSC/IRb（JSB）邊界擴張范圍顯示，紅花與11種菊科植物JSB邊界側翼基因為ycf1和ndhF基因。鋪散矢車菊和狹苞橐吾JSB邊界位于ycf1基因左翼，距離分別為0、1 bp，而紅花與其余9種菊科植物的JSB邊界均位于ycf1基因內，但擴張程度稍有差異。SSC/IRa（JSA）邊界擴張范圍顯示，而紅花與紫菀、鋪散矢車菊、狹苞橐吾和假臭草這5種菊科植物的JSA邊界均位于基因內，但擴張程度稍有差異，而下田菊與向日葵JSA邊界位于基因左翼、藿香薊、豚草、菊花、闊苞菊和鉆葉紫菀的JSA邊界位于基因的右翼；LSC/IRa（JLA）邊界擴張范圍顯示，JLA邊界，邊界處具有相同的基因，左翼為基因，右翼為基因，但擴張程度稍有差異。此外，鋪散矢車菊的葉綠體基因組在IRb區域，顯示具有基因，IRa區域存在2基因序列，但是沒有注釋，因此LSC/IRa邊界（JLA）中，基因名稱沒有顯示。

圖3 紅花及菊科11種植物的葉綠體全基因組邊界圖

3.5 菊科葉綠體基因組基因間隔區信息位點分析

基于紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）的葉綠體基因組間隔區信息序列特征統計表明（表4），在21個葉綠體基因間隔區中，變異位點百分率變化范圍為5.8%～28.8%，最高的trnH-GUG-psbA基因間隔區，其變異位點百分率為28.8%。變異位點百分率超過15%的有6個，分別為ndhC-trnV-UAC、psbE-petL、psbM-trnD-GUC、rps18-rpl20、trnH- GUG-psbA、trnS-GCU-trnC-GCA。變異位點百分率介于10%～15%的有11個，分別為atpB-rbcL、atpH-atpF、atpI-atpH、cemA-petA、psaI-ycf4、psaJ-rpl33、psbK-psbI、rpoC2-rps2、rps18-rpl20、trnC-GCA-petN、trnT-GGU-psbD、ycf4-cemA。變異位點百分率低于10%的有4個，分別為psaA-ycf3、psaA-ycf3、rps2-atpI、trnP-UGG-psaJ。這些變異位點百分率較高的葉綠體基因間隔區，能提供足夠多的信息位點，為菊科屬間和種間物種進化關系及分子鑒定提供較高的分辨率。

表4 菊科植物18種21個樣品葉綠體基因間隔區矩陣位點信息

3.6 菊科葉綠體全基因組系統發育分析結果

基于紅花及其近緣物種共18種（21個樣品）的葉綠體全基因組的系統發育樹結果顯示（圖4），菊科的管狀花亞科類群構成一單系分支，具有100%支持率。同一族取樣的物種聚在一起，單系性得到100%支持。在系統樹上，取樣類群可以分為3個主要分支，A分支是菜薊族構成的單系分支，具有100%支持率。紅花3種不同花色類型與NCBI數據庫的紅花樣品（登錄號：KM207677）聚在一支，具有100%支持率，進一步與鋪散矢車菊聚在一支，支持率均為100%。分支B包括2個族，紫菀族和千里光族均構成單系分支具有100%的支持率。分支C包括4個族，澤蘭族、向日葵族、旋覆花族和看黃菊族構成單系分支具有100%的支持率。

分支上部數值表示ML分析的BS分析對該分支的支持強度（＞50%）

4 討論

紅花作為我國傳統的大宗藥材之一，具有重要的藥用和經濟價值。本研究完成了藥用植物紅花3種花色類型的葉綠體基因組的測序，組裝與注釋。結果表明，紅花3種花色的葉綠體基因組序列完全一致，具有典型的4分區域結構（圖2），包括1個LSC區、1對IR區和1個SSC區，長度均為153 114 bp。葉綠體基因組數據支持紅花3種花色類型，來源為同一種紅花，準確鑒定了紅花3種花色變異類型的基原物種來源，確保了紅花臨床用藥的安全。紅花花色變異可能與花青素生物合成途徑相關轉錄因子分子調控機制有關[31]，淺黃色的紅花變異類型可能來源于橙紅色和白色的變異類型的自然雜交。

對比紅花與菊科其他物種的葉綠體基因組，結果表明紅花葉綠體基因組長度、IR區和LSC區長度，均位于菊科其他17個物種葉綠體基因組長度范圍之內。但紅花葉綠體基因組GC值及SSC區序列長度均高于菊科其他17個物種。紅花與菊科其他11個屬共12種植物的葉綠體基因組IR邊界分析（圖3）顯示，其LSC/IRb邊界（JLB），SSC/IRb邊界（JSB），SSC/IRa邊界（JSA）和LSC/IRa邊界（JLA）的側翼基因完全相同，各邊界基因序列的擴張長度略有差異。鋪散矢車菊的葉綠體基因組在IRb區域具有基因，同樣IRa區域也具有基因，但沒有注釋，因此LSC/IRa邊界（JLA）中，鋪散矢車菊基因名稱沒有顯示（圖3）。相對于葉綠體基因組編碼區基因具有較高的保守性，葉綠體基因組的基因間隔區往往具有豐富的變異位點，基于菊科管狀花亞科7個族18種植物（21個樣品）的葉綠體基因組間隔區信息序列特征統計表明（表4），變異位點百分率超過15%的基因間隔區有6個，分別為ndhC-trnV-UAC、psbE-petL、psbM-trnD- GUC、rps18-rpl20、trnH-GUG-psbA、trnS-GCU-trnC- GCA基因間隔區。其中trnH-GUG-psbA基因間隔區變異位點最高為28.8%。這些變異位點百分率較高的葉綠體基因間隔區，能提供足夠多的信息位點，為菊科屬下大范圍的物種鑒定，雜交起源，多倍體物種的形成和系統進化分析提供可靠的分子標記片段。

為進一步界定藥用植物紅花在菊科的系統位置，探討紅花屬與其近緣屬的系統發育關系。基于菊科18種（21個樣品）葉綠體基因組全長構建系統發育樹結果顯示，取樣的管狀花亞科所有類群聚在一單系分支具有100%支持率，紅花不同花色類型的樣品聚在一起具有100%支持率，紅花（所在紅花屬）與鋪散矢車菊（所在矢車菊屬）聚在一支，構成姐妹群（分支A）具有100%支持率。中國植物志記載[1]，菊科菜薊族的矢車菊亞族（Centaureinae）主要的特征在于它的瘦果有側生著生面，而藥用植物紅花（所在紅花屬）具有典型的瘦果有側生著生面的形態特征。本研究葉綠體基因組數據分子結果支持傳統分類研究結果[1]，再次驗證藥用植物紅花（所在紅花屬）隸屬于菜薊族的矢車菊亞族。

菊科是被子植物中種類最多的一個科，包含大量的藥用植物。同時菊科植物也是分布最廣的一個類群，是雙子葉植物中進化地位最高的一個科，物種形態變異多樣關[1]。本研究首次報道了藥用植物紅花不同花色變異類型的葉綠體全基因組，綜合分析菊科藥用植物如紅花、菊花、野菊花等的葉綠體基因組序列、結構和特征，篩選出一批高變異的葉綠體基因組的間隔區。這為菊科藥用植物的分子鑒定，種質資源保護，系統進化關系及遺傳多樣性研究奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志（第三十八卷） [M]. 北京: 科學出版社, 1986: 56.

[2] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 1088.

[3] 楊玉霞, 吳衛, 鄭有良. 紅花研究進展 [J]. 四川農業大學學報, 2004, 22(4): 365-369.

[4] 陳夢, 趙丕文, 孫艷玲, 等. 紅花及其主要成分的藥理作用研究進展 [J]. 環球中醫藥, 2012, 5(7): 556-560.

[5] Wu Z H, Liao R, Dong X,. Complete chloroplast genome sequence ofL. from PacBio sequel platform [J]., 2019, 4(2): 2635-2636.

[6] Twyford A D, Ness R W. Strategies for complete plastid genome sequencing [J]., 2017, 17(5): 858-868.

[7] Yu X Y, Zuo L H, Lu D D,. Comparative analysis of chloroplast genomes of fivespecies: Genome comparative and evolution analysis [J]., 2019, 689: 141-151.

[8] Zhang F, Wang T, Shu X,. Complete chloroplast genomes and comparative analyses of L., L. anhuiensis, and(Amaryllidaceae) [J]., 2020, 21(16): E5729.

[9] 邢少辰, Liu C J. 葉綠體基因組研究進展 [J]. 生物化學與生物物理進展, 2008, 35(1): 21-28.

[10] 張靖雯, 姜在民, 蔡靖. 紫丁香與羽葉丁香葉綠體DNA提取方法研究 [J]. 西北林學院學報, 2018, 33(4): 95-99.

[11] 倪梁紅, 趙志禮, 米瑪. 藥用植物葉綠體基因組研究進展 [J]. 中藥材, 2015, 38(9): 1990-1994.

[12] Antipov D, Hartwick N, Shen M,. plasmidSPAdes: Assembling plasmids from whole genome sequencing data [J]., 2016, 32(22): 3380-3387.

[13] Dierckxsens N, Mardulyn P, Smits G. NOVOPlasty: Deassembly of organelle genomes from whole genome data [J]., 2017, 45(4): e18.

[14] Jin J J, Yu W B, Yang J B,. GetOrganelle: A fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes [J]., 2020, 21(1): 241.

[15] Kim K J, Lee H L. Complete chloroplast genome sequences from Korean ginseng (schinseng Nees) and comparative analysis of sequence evolution among 17 vascular plants [J]., 2004, 11(4): 247-261.

[16] 李西文, 胡志剛, 林小涵, 等. 基于454FLX高通量技術的厚樸葉綠體全基因組測序及應用研究 [J]. 藥學學報, 2012, 47(1): 124-130.

[17] Zhang Y Z, Ma J, Yang B X,. The complete chloroplast genome sequence ofvar.(Taxaceae): Loss of an inverted repeat region and comparative analysis with related species [J]., 2014, 540(2): 201-209.

[18] Li X, Zhang T C, Qiao Q,. Complete chloroplast genome sequence of holoparasite(Orobanchaceae) reveals gene loss and horizontal gene transfer from its host(Chenopodiaceae) [J]., 2013, 8(3): e58747.

[19] 宋菊, 龍月紅, 林麗梅, 等. 五加科植物葉綠體基因組結構與進化分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(24): 5070-5075.

[20] Ma Y P, Zhao L, Zhang W J,. Origins of cultivars of—Evidence from the chloroplast genome and nucleargene [J]., 2020, 58(6): 925-944.

[21] Biswal D, Konhar R, Debnath M,. Chloroplast genome sequence annotation of(Asparagales: Orchidaceae), an endangered medicinal orchid from northeast India [J]., 2017, 9: ecurrents.tol.cf1709613759c2223eb582c0fa694cc7.

[22] Xia Z, Li C C, Hu S W,. The complete chloroplast genome of Chinese medicine cultivar species of(Orobanchaceae) [J]., 2021, 6(1): 290-292.

[23] Li C C, Hu S W, Ding Y N,. The complete chloroplast genome of Chinese medicinal herb(L.) Redouté (Iridaceae) [J]., 2021, 6(2): 331-332.

[24] Kearse M, Moir R, Wilson A,. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data [J]., 2012, 28(12): 1647-1649.

[25] Wang W B, Yu H, Wang J H,. The complete chloroplast genome sequences of the medicinal plant(Oleaceae) [J]., 2017, 18(11): 2288.

[26] Dong W L, Wang R N, Zhang N Y,. Molecular evolution of chloroplast genomes of orchid species: Insights into phylogenetic relationship and adaptive evolution [J]., 2018, 19(3): 716.

[27] 李世茂. 基于葉綠體DNA基因間隔序列的菊花與近緣種親緣關系研究 [D]. 武漢: 華中農業大學, 2010.

[28] Zhang D, Gao F L, Jakovli? I,. PhyloSuite: An integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies [J]., 2020, 20(1): 348-355.

[29] Katoh K, Standley D M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability [J]., 2013, 30(4): 772-780.

[30] Stamatakis A. RAxML version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies [J]., 2014, 30(9): 1312-1313.

[31] 李瑩, 高振蕊, 張馳, 等. 花青素合成途徑中分子調控機制的研究進展 [J]. 生態學雜志, 2015, 34(10): 2937-2942.

Characterization and phylogenetic analysis of complete chloroplast genome of different color medicinal plant

DING Yi-ning, BI Guang-yao, HU Sai-wen, ZHOU Yan, ZHOU Yan, LI He-min, XIA Zhi

College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China

In order to provide foundation formolecular identification and population genetics studies, we sequenced and assembled the complete chloroplast genome of three flower color variants,and constructed the phylogenetic relationship between it and its relatives.Genome DNA library was constructed with the paired-end strategy, and MGISEQ-2000PE150 platform was used to sequence in Beijing Genomics Institute (China). The complete chloroplast genome was assembled using NOVOPlasty software, and sequence analysis was performed based on gene annotation results. Phylogenetic analyses were performed using Maximum-Likelihood (ML) methods.The complete chloroplast genome of three different colorshas same length 153 144 bp with a GC content of 37.8%. The chloroplast genome exhibited a typical quadripartite structure, including a large single copy region (LSC), a pair of inverted repeats (IR), and a small single copy (SSC), and the sequence lengths were 84 128 bp, 25 194 bp, and 18 598 bp. The chloroplast genome harbored 130 genes, including 84 protein-coding genes, 8 rRNA genes, and 38 tRNA genes. Phylogenetic analyses result indicates that the three flower color variantsform one clade, and this clade is sister towith bootstrap 100%.Our result supported the three flower color variants offrom the same species. The medicinal plant(genus) belongs to Centaureinae of Cynareae in Asteraceae.

L.; chloroplast genome; assembly; phylogenetic analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0262 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.028

2022-07-06

河南省科技攻關項目（222102110137）；河南省高等學校重點科研項目計劃（22A360010）；國家自然科學基金項目（U1404302）

丁怡寧（1997—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向為中藥資源的分子鑒定。

通信作者：李賀敏，女，副教授，主要從事中藥資源的分類鑒定，E-mail: lihemin2002@henau.edu.cn

夏 至，教授，主要從事中藥資源的分子鑒定及分子生藥學研究。E-mail: xiazhiemail@126.com

[責任編輯 時圣明]