鳶尾糖基轉移酶編碼基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

張李兵，李 靜，陶無恙，黃梓璐，陳嘉杰，段禮新，季愛加

鳶尾糖基轉移酶編碼基因和克隆及特性研究

張李兵，李 靜，陶無恙，黃梓璐，陳嘉杰，段禮新，季愛加*

廣州中醫藥大學 中藥學院國際中醫藥轉化醫學研究所，教育部中醫藥防治腫瘤轉化醫學研究國際合作聯合實驗室，廣東 省中醫藥防治腫瘤轉化藥學研究重點實驗室 廣東 廣州 510000

克隆獲得鳶尾糖基轉移酶基因和，并對其進行生物信息學分析、基因差異表達檢測和蛋白原核表達等特性分析。以鳶尾轉錄組中篩選到的基因全長開放閱讀框（open reading frame，ORF）設計特異性引物，進行PCR擴增，經測序后獲得基因序列并進行生物信息學分析；通過熒光定量PCR（real-time PCR，qRT-PCR）進行基因差異表達檢測；最后構建pET-32a（+）原核表達載體在大腸桿菌中表達蛋白。PCR擴增和的ORF長度分別為1461、1488 bp，編碼蛋白相對分子質量大小分別為53 830、54 910。熒光定量PCR顯示，的表達量在葉片中最高，而在花器官中表達最高。進化樹表明，ItUGT419與三萜類糖基轉移酶聚類在一起，ItUGT349與三萜、黃酮和木質素等多種類型的糖基轉移酶聚類到一支。ItUGT349和ItUGT419在大腸桿菌中均成功的表達出可溶性蛋白。通過和基因全長ORF克隆，并對其進行序列分析，基因差異表達檢測及原核表達等研究，為后續進一步鑒定其催化功能奠定基礎。

鳶尾；糖基轉移酶；基因克隆；生物信息學分析；原核表達；qRT-PCR

鳶尾科植物鳶尾Maxim.廣泛分布于世界各地，具有悠久的民間用藥歷史，其主要化學成分黃酮類和三萜類化合物對多種疾病如癌癥、炎癥及病毒感染等均具有很好的療效，具有極高的藥用價值，《中國藥典》2010年版正式將其收錄[1]。目前已從鳶尾中分離出多種三萜及其皂苷類化合物，特別是一系列結構新穎的鳶尾醛型三萜，其結構特征在于一個多取代環己烷的C-11位上連有一個側鏈，C-6位連有一個羥丙基可被糖基化[2]；在抗腫瘤和抗癌方面表現出良好活性[3]。

糖基化是植物次生代謝過程中十分重要的一類化學反應；在尿苷二磷酸（UDP）依賴性糖基轉移酶（UGTs）的作用下，將UDP活化的糖作為主要的供體分子轉移到特定的受體分子，形成糖苷鍵，產生多種多樣的糖苷類化合物[4]。被糖基化的化合物可顯著提高水溶性、化學穩態以及轉運能力等, 也能促進其在某些特定的植物細胞或組織中進行儲存和積累[5]。植物中的UGTs是一個基因超家族，已在許多植物中被克隆和表征功能[6-8]。此外在模式植物擬南芥L.中，已經報道了120個基因[9]；雙子葉植物大豆L.中報道182個基因[10]；單子葉植物水稻L.中有180個基因被報道[11]。由于UGTs家族成員眾多，且催化底物復雜，其基因功能仍有許多未知。有研究指出，UGTs在C端均具有一個高度保守基序PSPG box（putative secondary plant glycosyl-transferase），該保守基序被認為是UDP-糖供體結合的區域；而在N端的序列變異則十分顯著，其可能具有對萜類、黃酮類和甾體類等不同的底物進行選擇性結合的功能[12-14]。

目前植物中關于催化三萜類化合物糖基化的糖基轉移酶基因已有不少報道；如從王不留行中克隆的從燕麥中克隆的和從大豆中克隆的、、等；其編碼糖基轉移酶蛋白均可對三萜骨架或側鏈進行糖基化修飾[15-17]。鳶尾中存在著眾多結構新穎的三萜及皂苷類成分，但相關糖基轉移酶的研究卻未見報道。本研究通過對鳶尾轉錄組數據進行分析，篩選并克隆了2條糖基轉移酶基因（和），并通過生物信息學分析、基因差異表達分析；推測其可能具有催化三萜類底物糖基化的功能。最后在大腸桿菌中進行了蛋白體外表達研究，為進一步鑒定其催化功能、解析鳶尾中三萜類成分生物合成途徑奠定基礎。

1 材料

本研究所用植物材料于2019年6月取自中國科學院植物研究所，經廣州中醫藥大學中藥學院季愛加副研究員鑒定為鳶尾Maxim.。選取生長年限2年，生長健壯，處于盛花期的鳶尾植物，各組織部位取材后立即置于液氮速凍，置于?80 ℃冰箱備用。

2 方法

2.1 RNA提取及反轉錄

采用液氮研磨法，使用植物總RNA提取試劑盒（北京興華越洋生物科技有限公司）按試劑盒操作說明提取鳶尾各部位總RNA。將提取的總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用核酸定量儀檢測RNA濃度。參照TakaRa公司的PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TakaRa公司，6210A）試劑盒中的操作說明合成cDNA鏈。

2.2 ItUGTs基因克隆

從鳶尾轉錄組數據中篩選到2條潛在的糖基轉移酶基因，命名為和。根據其全長開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，使用Vector NTI設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列信息見表1。以高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，P505-d1）對候選基因片段進行PCR擴增反應，反應體系為2 ×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，高保真酶1 μL，正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，超純水補足至50 μL。反應程序為95 ℃預變性3 min；然后95 ℃、15 s，57 ℃、15 s，72 ℃、90 s，32個循環；終延伸72 ℃，5 min。PCR產物經電泳、切膠回收純化后連接pLB-T載體并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布含氨芐抗性的LB固體平板；于37 ℃恒溫培養箱中，暗培養12～15 h。挑取單菌落小搖5～6 h，進行菌液PCR陽性鑒定，將陽性菌液送至生工生物工程上海股份有限公司測序。

2.3 ItUGTs生物信息學分析

使用NCBI在線工具ORF Finder （https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）搜索和糖基轉移酶基因序列的開放閱讀框；經ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）網站獲得預測蛋白的理化性質。通過CELLO v 2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）獲得蛋白亞細胞定位信息；利用在線工具SignalP-5.0（http://www. cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）和TMHMM（http:// www. cbs. dtu. dk/ services/TMHMM/）預測蛋白信號肽和跨膜區。通過SOPMA（https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預測蛋白二級結構，再經SWISS-MODEL（https://swissmodel. expasy.org/ interactive）進行同源模建，獲得蛋白的三維結構。通過NCBI-cdd（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd）在線工具和pfam（http:// pfam.xfam.org/）網站預測蛋白的結構域范圍，利用DNAMAN軟件進行序列比對。再使用MEGA 7.0軟件構建系統發育進化樹；已知功能糖基轉移酶蛋白序列[14,18]從NCBI（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫下載。

表1 引物序列

2.4 ItUGTs基因qRT-PCR分析

參照TakaRa公司的qRT-PCR反轉錄試劑盒（TakaRa公司，RR047A）中的操作說明合成cDNA鏈，用于qPCR反應的模板。參照艾科瑞生物公司的SYBR Green Pro Taq HS預混型qRT-PCR試劑盒說明書，使用QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀進行檢測，將鳶尾各組織部位cDNA稀釋20倍作為qRT-PCR反應體系模板，以為內參基因（引物序列見表1）；每個基因3個生物學重復，3個技術重復。反應體系10 μL：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix，5.0 μL；正反向引物各0.2 μL；熒光染料0.2 μL；模板cDNA 1 μL；超純水3.4 μL。反應條件：95 ℃，30 s；40個循環（95 ℃，5 s；64 ℃，34 s）。使用2?△△Ct法計算基因在不同組織部位中的相對表達量。使用IBM SPSS 2.0軟件進行表達差異的統計分析，＜0.01表示顯著性差異。

2.5 ItUGTs基因原核表達

參照南京諾唯贊生物科技有限公司的快速重組克隆試劑盒（ClonExpress II）盒說明書對候選基因片段進行PCR擴增。擴增產物經膠回收純化后，采用雙酶切（EcoRI，XhoI）進行pET32a載體線性化，通過同源重組酶將二者重組，同源產物轉化至大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐抗性的平板上，過夜培養（37 ℃），經菌液PCR鑒定，選取陽性菌液送測序，將測序正確的菌液活化，提取質粒，獲得帶目的基因的表達載體質粒。

通過熱激法將重組質粒轉入宿主菌BL21(DE3) 感受態，挑取陽性克隆菌于LB 液體培養基（含100 mg/L氨芐抗生素）中進行震蕩培養，4～6 h后通過紫外分光光度計檢測菌液密度至OD值為0.5～0.6時，加入終濃度0.1 mmol/L IPTG，18 ℃、180 r/min，誘導培養18 h。4 ℃、4000 r/min 離心10 min 收集菌體，棄上清。在菌體中加入20 mL的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）重懸菌體，蛋白破碎前加入1 mmol/L PMSF，超聲破碎。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，分離上清及沉淀。進行SDS-PAGE。

3 結果與分析

3.1 ItUGTs基因克隆

以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，可見和均為1條清晰條帶（圖1），片段大小在1500 bp左右，與預期大小相符。陽性克隆測序結果與轉錄組序列比對，結果一致。基因的ORF長度為1461 bp，編碼486個氨基酸，命名為UGT707D1；基因的ORF長度為1488 bp，編碼495個氨基酸，命名為UGT92N1。

3.2 ItUGTs的序列分析

3.2.1 ItUGTs蛋白理化性質 經ProtParam在線工具預測，ItUGT349和ItUGT419相對分子質量分

圖1 PCR產物凝膠電泳圖

別為53 830和54 910，理論等電點分別為4.94、4.92，不穩定系數為53.69、49.58，表明ItUGT349和ItUGT419均屬于不穩定酸性蛋白。

3.2.2 ItUGTs跨膜區及信號肽分析 亞細胞定位預測表明，2個ItUGTs均定位于細胞質。通過在線工具TMHMM預測蛋白跨膜區，發現2個ItUGTs均不含有跨膜螺旋區（圖2），為膜外蛋白。利用在線工具SignalP-5.0對ItUGTs進行信號肽預測，發現ItUGT349具有信號肽（圖2），為分泌蛋白；ItUGT419不具有信號肽，為非分泌蛋白，二者可能具有不同的生物學功能。

3.2.3 ItUGTs蛋白二級結構及三維建模 二級結構分析表明，ItUGT349和ItUGT419均以α螺旋和無規卷曲為主要組成元件，其具體預測信息見表2。

使用在線工具SWISS-MODEL預測ItUGT349和ItUGT419蛋白三維結構。ItUGT349蛋白與蒺藜苜蓿三萜UDP-葡萄糖基轉移酶（UGT71G1）具有42.70%的序列相似性，以該蛋白（PDB ID：2acw.1）A鏈[19]為模板，通過同源建模構建ItUGT349蛋白的三級結構，建模范圍為2～485位氨基酸，全球性模型估測值（GMQE值）為0.68，三維建模質量良好（圖3）。ItUGT419蛋白與美洲商陸糖基轉移酶（UGT3）具有32.83%的序列相似性，以該蛋白（PDB ID:6lzx.1）A鏈[20]為模板，通過同源建模構建ItUGT419蛋白的三級結構，建模范圍為4～488位氨基酸，GMQE值為0.67，三維建模質量良好。

A、B-ItUGTs跨膜區預測 C、D-ItUGTs信號肽分析

表2 ItUGTs蛋白二級結構預測

圖3 鳶尾ItUGTs蛋白三級結構預測

3.3 ItUGTs的系統發育與結構域分析

根據糖基轉移酶的底物催化特異性，將擬南芥、大豆、人參、蒺藜苜蓿、梔子等植物中已表征功能的糖基轉移酶與ItUGT349和ItUGT419進行系統發育分析（圖4）。結果顯示，ItUGT419聚類在第3支（Group III），與人參和麥藍菜中的三萜類糖基轉移酶聚類在一起；而ItUGT349聚類在第2支（Group II），與已知功能的三萜類，黃酮類等糖基轉移酶聚類在一起。

使用NCBI-CD-Search和Tbtools工具對其結構域進行預測，發現ItUGT349和ItUGT419與已知功能的三萜類糖基轉移酶具有相同的結構域（GTB-type superfamily）。進一步使用pfam在線軟件對其結構域序列進行分析，并使用DNAMAN進行多序列比對（圖5），發現ItUGT349和ItUGT419與三萜類糖基轉移酶的氨基酸序列具有較高的一致性，結構域全長約150個氨基酸。在與黃酮類糖基轉移酶的序列比對中發現，其結構域較三萜類的更長，約330個氨基酸；ItUGT349和ItUGT419在C端區域較為保守，在N端存在大片段的缺失。

3.4 ItUGTs的組織差異表達分析

以鳶尾為內參基因，通過qRT-PCR檢測和基因在鳶尾根狀莖、葉片和花中的差異表達情況，結果見圖6，在葉片中有最高表達；在花中的表達量最高。

AtUGT-擬南芥 SrUGT-甜葉菊 PgUGT-人參 MpUGT-蒺藜苜蓿 GjUGT-梔子 GuCGAT-麥藍菜 GmUGT-大豆 BvUGT-歐洲山芥

3.5 ItUGTs的原核表達

將構建好的重組質粒pET32a(+)-ItUGT349、pET32a(+)-ItUGT419轉入宿主菌BL21(DE3)，通過菌液PCR篩選轉化陽性菌液進行IPTG誘導表達。在IPTG的誘導作用下，和在大腸桿菌體系中進行異源表達，經SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況，結果見圖7。ItUGT349重組蛋白相對分子質量理論值為74 230，通過與空載表達情況對照，發現成功表達出較大量的可溶性蛋白；ItUGT419重組蛋白大小理論值為75 310，通過與空載表達情況對照，發現可溶性蛋白達較少，蛋白主要表達在沉淀中。

4 討論

糖基轉移酶是植物次生代謝產物的結構修飾酶，可催化三萜、黃酮、甾體生物堿等眾多化合物進行糖基化修飾。藥用植物中的主要次生代謝產物通常為其藥效物質基礎，糖基化修飾對藥效成分生化活性及藥理作用具有顯著的影響。如穿心蓮中經糖基化修飾后生成的新穿心蓮內酯，其水溶性增加了數倍[21]。人參中含有的多種人參皂苷，其糖基化修飾的差異會使得同種皂苷產生不同甚至截然相反的藥理作用[22]。當前對糖基轉移酶的研究還有很多未知，一直是國內外研究熱點。鳶尾作為一種傳統的藥用植物，其中含有多種三萜及其皂苷類成分，具有重要的藥理活性[1-3]。本研究基于鳶尾轉錄組數據，篩選并克隆了2條糖基轉移酶基因，經進化樹分析，初步推測ItUGT349和ItUGT419可能以三萜類化合物作為底物進行糖基化反應，但ItUGT349可能具有更寬泛的底物選擇性。有研究指出，糖基轉移酶的底物選擇性與Ｎ端結構域序列的差異高度相關[23-25]。如從茶樹中分離得到的糖基轉移酶CsUGT78A14可專一性的催化黃酮類化合物的糖基化反應；而另一個糖基轉移酶Cs UGT72AM1則可催化黃酮醇、花青素、木質素等多種底物進行糖基化反應，二者C端序列高度保守但在Ｎ端則存在顯著差異[26-27]。進一步對鳶尾糖基轉移酶ItUGT349 和ItUGT419結構域序列進行分析發現ItUGT349和ItUGT419的N端結構域與三萜類的糖基轉移酶相似度更高，較黃酮類的糖基轉移酶則存在大片段的缺失，其可能導致對黃酮類底物的選擇性降低。

PhF3GT-矮牽牛F3GT Cp3GT-葡萄柚3GT CsUGT-茶樹UGT FiF3GT-連翹F3GT PfF3GT-紫蘇F3GT PjGAT-竹節參GAT

采用單因素方差分析，*P＜0.01 存在顯著性差異

M-Marker 1～3依次為BL21(DE3)-pET32a(+)全蛋白、可溶性蛋白、沉淀 4～6依次為ItUGTs全蛋白、可溶性蛋白、沉淀

吳世丹[28]對鳶尾中的幾種重要的三萜類成分進行了含量分析，發現其在葉片中含量非常高，而根狀莖中的含量較低。通過熒光定量PCR檢測和基因在鳶尾根狀莖、葉片和花組織中的表達情況；和基因差異表達與鳶尾各組織中三萜類化合物的積累趨勢較為一致，故推測ItUGT349和ItUGT419糖基轉移酶更可能參與鳶尾地上部分組織中的糖基化反應。進一步驗證糖基轉移酶基因功能，需要通過蛋白原核表達，獲得相應的酶蛋白，并與各種類型的底物進行體外酶促反應；其中可溶性融合蛋白的成功表達對后續鑒定酶的功能至關重要。

本研究通過構建ItUGT349和ItUGT419原核表達載體，在大腸桿菌中進行蛋白表達，ItUGT349和ItUGT419均表達出可溶性蛋白，但ItUGT419可溶性蛋白表含量較低。有研究指出，融合蛋白可能會以包涵體的形式聚集在沉淀中，這與蛋白是否含有跨膜區及是否為分泌蛋白有關[29]；除此之外，蛋白的溶解性還與基因序列、蛋白空間結構、表達載體、菌株及誘導條件等有關[30]。本課題組在誘導表達過程中對誘導培養的溫度和誘導劑（IPTG）的使用量等參數進行了摸索，依然不能很好的提高ItUGT419的可溶性蛋白含量；下一步將繼續優化表達系統或使用發酵罐增大菌體的誘導量，來獲得較大量的ItUGT419可溶性蛋白，為后續體外酶促反應鑒定酶功能提供足夠的酶蛋白。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genes clone and features analysis of glycosyltransferase genesandfrom

ZHANG Li-bing, LI Jing, TAO Wu-yang, HUANG Zi-lu, CHEN Jia-jie, DUAN Li-xin, JI Ai-jia

Guangdong Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Research of Chinese Medicines, Joint International Research Laboratory of Translational Cancer Research of Chinese Medicines, International Institute for Translational Chinese Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, China

To clone the glycosyltransferase genesandfromand conduct bioinformatics analysis, gene differential expression analysis and protein prokaryotic expression analysis.Gene-specific primers were designed based on the open reading frame (ORF) of, which were screened from the transcriptome data; And the gene products were obtained by PCR amplification. After sequencing identification, bioinformatics analysis was performed. Moreover, the different expression of both genes among various tissues were detected by real-time qPCR. Finally, the target gene was constructed into the prokaryotic expression vector pET-32a (+) and the soluble proteins were obtained in.The length of open reading frame (ORF) ofandwere 1461 bp and 1488 bp, respectively; And the molecular weight of the encoding proteins were 53 830 and 54 910. The fluorescence quantitative PCR results showed that the expression level ofwas highest in leaves, whilewas highly expressed in flowers. The phylogenetic tree showed that ItUGT419 was clustered with the UGTs, which were related to triterpene biosynthesis; And ItUGT349 was clustered with the UGTs, which were involved in the biosynthesis of triterpene, flavonoids and lignin. Finally, ItUGT349 and ItUGT419 were successfully expressed in.The full-length ORF cloning, sequences analysis, differential gene expression detection and prokaryotic expression ofandlay a foundation for the subsequent identification of their catalytic function in.

Maxim.; glycosyltransferase; gene cloning; bioinformatics analysis; prokaryotic expression; qRT-PCR

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0254 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.027

2022-05-06

國家自然科學基金青年基金項目（82003895）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2019A1515110594，2020A1515010926）；廣東省級大學生創新訓練項目（S202110572094，S202110572055）

張李兵，男，碩士研究生，研究方向為藥用植物功能基因組學。

通信作者：季愛加，女，副研究員，藥用植物功能基因組學。E-mail: ajji@gzucm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]