三七藥渣中主要多糖成分的分離純化及其抗氧化活性研究

曹玉標，孫亮亮，楊 野，崔秀明，邱 斌，王承瀟*

三七藥渣中主要多糖成分的分離純化及其抗氧化活性研究

曹玉標1, 2，孫亮亮1, 2，楊 野1, 2，崔秀明1, 2，邱 斌3*，王承瀟1, 2*

1. 昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500 2. 云南省三七資源可持續利用重點實驗室，云南昆明 650500 3. 云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500

分離純化三七藥渣中主要多糖組分，分析其單糖組成，并對比研究各組分多糖的抗氧化活性。采用水提醇沉法提取三七藥渣粗多糖；經DEAE Fast Flow陰離子交換柱、Sephadex G-50柱色譜法進行分離純化。采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法測定其相對分子質量及純度，通過掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared spectroscopy，FT-IR）、HPLC-衍生化等方法對各組分多糖的單糖組成和初級結構進行分析。分析其抗氧化能力以及對RAW 264.7細胞氧化損傷的保護作用。分離得到3個多糖組分（PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3），3者的單糖組成和比例存在差異：PNPS-0主要由-葡萄糖（52.28%）和-半乳糖（34.14%）組成；PNPS-0.2主要由-半乳糖（40.89%）、-阿拉伯糖（19.38%）和-葡萄糖（12.25%）組成；PNPS-0.3主要由-葡萄糖醛酸（40.43%）、-半乳糖（22.61%）和-葡萄糖（18.32%）組成。抗氧化結果表明，PNPS-0.3的總還原能力最強，對DPPH自由基、OH?自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子自由基的清除活性最高，對RAW 264.7細胞氧化損傷保護作用最好，并呈現濃度相關性。從三七藥渣中得到了3種具有抗氧化活性的多糖片段，抗氧化活性與多糖結構密切相關。為三七資源的二次開發利用提供了新的研究思路。

三七；多糖；構效關系；單糖組成；抗氧化；藥渣；高效凝膠滲透色譜；-葡萄糖；-半乳糖；-阿拉伯糖；-葡萄糖醛酸

中藥藥渣是指從中藥材中提取目標活性成分后所產生的廢料、廢渣。高濕中藥渣較易滋生微生物菌而發霉變質，發出惡臭氣味，堆放占用大量空間，掩埋會造成地下水的二次污染，曬干焚燒又會帶來環境污染，均不利于生態環保，嚴重制約中藥產業的可持續發展[1]。隨著中醫藥產業持續健康發展目標的提出以及綠色環保和可持續發展理念日益深入人心，越來越多的研究趨向于中藥材資源最大化利用[2]。

三七是五加科人參屬植物三七(Burk.) F. H. Chen的干燥根及根莖，多數以三七入藥的產品（諸如血塞通、復方丹參滴丸等）以皂苷成分入藥[3-4]，醇提皂苷成分后殘留的藥渣被丟棄。藥渣殘留的大量生物活性物質，如多糖、氨基酸類（主要為三七素）、蛋白質類、揮發油等[5]尚未得到有效利用。因此，深入挖掘、利用三七藥渣中的活性成分，變廢為寶，不僅能增加企業的經濟效益，而且對三七的二次開發利用和資源的可持續發展具有重要研究意義和應用價值。

三七多糖（polysaccharides）是三七藥渣中大量存在的活性物質。本課題組前期研究表明，三七多糖具有調節機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[6]。本研究擬以三七藥渣廢棄物為研究對象，從中獲取具有生理活性的多糖片段，系統分析其結構組成，并從離體-細胞水平對其抗氧化活性進行研究。在此基礎上，探索并闡明三七多糖結構-活性之間的內在關聯。本研究可為中藥藥渣資源開發利用提供新的研究視角，同時為三七資源的可持續利用提供新的研究思路和技術儲備。

1 材料與儀器

1.1 儀器

HF-100 CO2型培養箱，上海力康生物有限公司；Scientz-10ND型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；CTK-32R型高速離心機，湖南湘儀儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，日本島津公司；CKX41型倒置顯微鏡，中國奧林巴斯有限公司；3100高效液相色譜儀，依利特分析儀器有限公司；Varioskan LUX型酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；MIRA LMSALPHAII型掃描電子顯微鏡（SEM），捷克泰思肯有限公司；EMXplus-6/1型順磁共振波譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克科技有限公司；Nikon Eclipse C1激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 材料

三七藥渣，皂苷提取工藝中產生的廢棄物，批號210813，來源于昆明華潤圣火藥業有限公司；RAW264.7細胞，購自北京協和細胞資源中心；-無水葡萄糖（Glu），批號1122A0219，質量分數＞98%，北京索萊寶科技有限公司；-鼠李糖（Rha，批號O12A10K95105，質量分數＞98%）、-阿拉伯糖（Ara，批號J24M10R89091，質量分數＞98%）、-木糖（Xyl，批號D17N9S74410，質量分數＞99%）、-甘露糖（Man，批號C25D8H51117，質量分數＞99%）、-半乳糖（Gal，批號H16N10C102439，質量分數＞99%）、-半乳糖醛酸（GalUA，批號M13N10C64281，質量分數＞97%）、-葡萄糖醛酸（GluUA，批號P28N10F37892，質量分數＞96%），均購于上海源葉生物科技有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow填料，美國Cytiva公司；Sephadex G-50填料以及各規格單糖標準品，上海源葉生物科技有限公司。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），批號FI190025，薩恩化學技術（上海）有限公司；三氟乙酸（TFA），批號RH240475，廣州蘇維化工有限公司；抗壞血酸（維生素C，VC），批號20200520，國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH），批號C12550543，上海麥克林公司；2,2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS，批號091021220530）、熒光紅染料（Ample Red，批號030722220414）、MTT（批號020328905117）、DAPI染色液（批號021119313462），均購于碧云天生物技術有限公司；色譜級乙腈，美國Sigma公司；胎牛血清（FBS，批號2148389）、DMEM培養基（批號8122030），均購于美國Gibco公司；總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號20210619）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（批號20210801）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（批號20210716），均購于南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 粗多糖的提取

工業生產中常用70%乙醇提取三七皂苷，用大孔樹脂純化皂苷，而多糖等其他大分子有效成分仍留在廢渣、廢液中，未得到有效利用。參照于少朋等[7]的方法，取三七藥渣200 g，粉碎后過80目篩，加入20倍體積的蒸餾水，浸泡4 h，75 ℃提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至總體積的1/5，4500 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min，棄沉淀，使用Sevage法[8]脫蛋白質。然后加入3倍體積無水乙醇，4 ℃靜置24 h使其完全沉淀，4500 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min，將離心后的多糖加水復溶后在60 ℃水浴揮發至無明顯的乙醇氣味，透析［截留相對分子質量（w）3500］后凍干得粗多糖。計算粗多糖提取率（提取率＝凍干粗多糖質量/三七藥渣質量），重復3次取平均值。粗多糖提取流程見圖1，得率為3.12%。

2.2 粗多糖的分離純化

將粗多糖溶解在蒸餾水中，配制成10 mg/mL溶液，使用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱（60 cm×4 cm，體積流量1 mL/min，0～1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫）、Sephadex G-50葡聚糖凝膠色譜柱（110 cm×2.4 cm，體積流量0.5 mL/min，0.1 mol/L NaCl洗脫）對粗多糖進一步純化。以每管10 mL收集洗脫液，苯酚-硫酸法[9]檢測洗脫液490 nm處吸光度（）值并繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線收集樣品，透析（截留w3500），真空冷凍干燥。將多糖組分制成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液，200～400 nm波長下進行紫外掃描，檢測樣品中核酸、蛋白質及肽類等雜質的含量。經過進一步分離純化得到粗多糖中主要含有3個組分PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3，洗脫曲線見圖2，得率分別為10.26%、32.15%、23.27%。各組分多糖通過紫外吸收光譜全波長掃描后，均在260、280 nm處均無明顯吸收峰，表明純化后的多糖組分不含核酸、蛋白質及肽類等雜質。

圖1 PNPS提取分離工藝流程和DEAE Sepharose Fast Flow瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線

圖2 多糖組分Sephadex G-50凝膠柱的洗脫曲線

2.3 多糖組分的初級結構表征

2.3.1 多糖組分純度和w測定 精密稱定樣品和對照品5.0 mg，樣品配制成5.0 mg/mL溶液，12 000 r/min（離心半徑為 6.3 cm）離心10 min，取上清液過濾（0.22 μm），通過HPGPC測定多糖w和純度。色譜條件：色譜柱為BRT105-104-102串聯凝膠柱（300 mm×8 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L NaCl溶液；體積流量0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μL；檢測器：RI-10A示差檢測器；lgw-R校正曲線方程為lgw＝12.27－0.193 7R，2＝0.992 9。結果（圖3）表明，3個多糖組分均為單峰，PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3均為純度較高的均一多糖，w分別為29 152、173 876、104 201。

圖3 多糖組分HPGPC色譜圖

2.3.2 多糖組分的SEM分析 取少量各組分多糖的凍干粉末均勻粘在導電膠上，真空噴金制樣，操作電壓為3.0 kV，觀察其微觀結構。結果如圖4所示，各組分多糖的表面基本相似，PNPS-0.2和PNPS- 0.3表面光滑絲狀，PNPS-0相比于PNPS-0.2和PNPS-0.3表面稍粗糙，沒有明顯的微觀形態變化。

圖4 多糖組分SEM圖(比例尺1 μm)

2.3.3 多糖組分的FT-IR分析 將2 mg多糖樣品與200 mg干燥KBr一起研磨混勻，用壓片機壓成薄片后用FT-IR光譜儀在4000～500 cm?1進行掃描，記錄掃描圖譜。結果如圖5所示，約在3415 cm?1為多糖的-OH伸縮振動特征峰；在2929 cm?1附近為-C-H的伸縮振動吸收峰。約在1741 cm?1和1630 cm?1處由酯羰基（-COOR）和羧酸酯（-COO?）伸縮振動造成的吸收峰在3組分多糖中區別尤為明顯，提示PNPS-0.2、PNPS-0.3中含有羧基官能團[10]。約在906 cm?1處的吸收峰，表明存在-吡喃葡萄糖基[11]。在964～1147 cm?1的值表示含有吡喃糖單位[12]，約在1248 cm?1為糖醛酸單元的羧酸部分吸收峰，約在1020、1108 cm?1處相對強的吸收峰，代表糖醛酸含量[13]，得出PNPS-0.3中糖醛酸含量較高。

圖5 多糖組分FT-IR圖譜

2.3.4 多糖組分的單糖組成分析 采用PMP柱前衍生化的方法[14]分析單糖組成。單糖對照品的制備：精密稱定甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖各標準單糖5.0 mg，溶于8 mL濃氨水中，取800 μL加入等體積PMP（0.5 mol/L），70 ℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，加入3 mL的水，置于55 ℃真空干燥箱揮干，加水重復2次。加入1 mL去離子水和1 mL氯仿，渦旋萃取3～5次除去多余的PMP，收集上層水相，濾過（0.22 μm），待用。多糖組分樣品制備：參考Qiao等方法[15]，精密稱定5.0 mg多糖，加入2 mL TFA（4 mol/L），120 ℃油浴攪拌6 h至溶液澄清透明，冷卻至室溫。揮干TFA。隨后將水解產物溶于300 μL濃氨水，渦旋混勻。按上述單糖衍生化方法處理，待用。

色譜條件：依利特E3121805色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相配比為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.7）-乙腈（83∶17），體積流量1 mL/min，檢測波長245 nm。結果如圖6所示，3種多糖具有不同的單糖組成和比例。如表1所示，其中PNPS-0主要由-葡萄糖和-半乳糖組成，物質的量占比分別為52.58%和34.14%；PNPS-0.2主要由-半乳糖、-阿拉伯糖和-葡萄糖組成，物質的量占比分別為40.89%、19.38%和12.25%；PNPS-0.3主要由-葡萄糖醛酸、-半乳糖和-葡萄糖組成，物質的量占比分別為40.43%、22.61%、18.32%。就糖醛酸含量而言，PNPS-0.3中含量最高為42.26%（物質的量占比），明顯高于前兩者，與FT-IR結果一致。

A-混合對照品 B-PNPS-0 C-PNPS-0.2 D-PNPS-0.3 1-PMP 2-Man 3-Rham 4-GalUA 5-GlcUA 6-Glc 7-Gal 8-Xyl 9-Ara

表1 單糖組成

2.4 多糖組分體外抗氧化活性研究

以VC為陽性對照，去離子水為空白對照進行下列抗氧化活性評價。

2.4.1 DPPH自由基清除活性測定 分別準確配制0～5 mg/mL濃度梯度的多糖樣品，參考Fan等[16]的方法，取500 μL樣品加入500 μL的DPPH溶液，避光渦旋混勻，放置30 min，5000 r/min（離心半徑為6.3cm）離心10 min。取上清液于517 nm下測值，按下式計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率＝1－(1－2)/3

結果如表2所示，陽性對照VC在5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為90.07%。PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時對DPPH自由基均具有一定的清除率能力，且呈明顯濃度相關性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現出最強的DPPH自由基清除能力，IC50值為2.94 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對DPPH自由的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高8.49%、28.55%（＜0.01）。

2.4.2 OH?自由基清除能力測定 分別準確配制0～5 mg/mL質量濃度梯度的多糖樣品，參考Xie等[17]方法，取500 μL樣品，依次加入等體積6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液、8 mmol/L H2O2溶液（啟動反應），37 ℃水浴加熱60 min，于510 nm測定值。按“2.4.1”項公式計算羥基自由基的清除率。

表2 多糖組分對DPPH自由基的清除能力(, n = 3)

與PNPS-0組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與PNPS-0.2組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001PNPS-0 group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001PNPS-0.2 group, same as below tables

結果如表3所示，陽性對照VC在5 mg/mL時，對OH?自由基的清除率為96.09%。PNPS-0、PNPS- 0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時對OH?自由基均具有一定的清除率能力，且呈明顯濃度相關性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現出最強的抗氧化活性，IC50為0.97 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對OH?自由基的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高22.23%、53.59%（＜0.01）。

2.4.3 ABTS自由基清除活性測定 參考He等[18]方法，將0～5 mg/mL質量濃度梯度的多糖樣品10 μL加入200 μL ABTS工作液，室溫避光孵育6 min，于734 nm下測值。按“2.4.1”項計算ABTS自由基清除率。

結果如表4所示，陽性對照VC在5 mg/mL時對ABTS自由基的清除率分別為98.73%。PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時對ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈明顯濃度相關性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS- 0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現出最強的ABTS自由基清除能力，IC50值為2.15 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對ABTS自由基的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高2.07%、34.48%（＜0.01）。

2.4.4 總還原力測定 參考Huo等[19]的方法，分別吸取0～5 mg/mL質量濃度梯度的多糖樣品溶液250 μL，加入等體積的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃條件下孵育20 min，隨后加入250 μL 10%三氯乙酸，4000 r/min（離心半徑為6.3 cm）離心10 min，取上清液500 μL，加入等體積0.1%三氯化鐵，在700 nm波長處檢測值。檢測獲得的值即為總還原力。

表3 多糖組分對OH?自由基的清除能力(, n = 3)

表4 多糖組分對ABTS自由基的清除能力(, n = 3)

結果如表5所示，相同劑量下，各組分多糖的總還原能力為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0，與體外自由基清除趨勢一致。

2.4.5 順磁共振波譜檢測多糖組分對DPPH、OH?、超氧陰離子自由基的清除能力 將各組分多糖配置成5 mg/mL溶液，參考Romanet等[20]的方法，取等量的分散液和捕獲劑混合，再用毛細管吸取適量混合液，加入石英管后插入樣品腔。以自由基捕獲劑5,5-二甲基-1-吡咯啉--氧化物（5,5-dimethyl- 1-pyrroline-oxide，DMPO）為對照，對樣品進行掃譜，通過EPR譜圖分析各組分多糖對DPPH自由基、OH?自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。

EPR結果顯示（圖7），各組分多糖對DPPH自由基、OH?自由基、超氧陰離子自由基存在一定的清除能力，其中PNPS-0.3的清除能力最強，與體外自由基清除趨勢一致。

表5 多糖組分的總還原能力(, n = 3)

圖7 各組分多糖EPR抗氧化分析

2.5 多糖組分對RAW264.7細胞氧化損傷保護作用的研究

2.5.1 RAW264.7細胞的培養 RAW264.7細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基中，于37 ℃和5% CO2的培養箱中培養。

2.5.2 多糖對H2O2誘導RAW264.7細胞損傷的保護作用 參考Wang等[21]的方法，將指數生長期的RAW264.7細胞以1×104個/孔接種在96孔板中。12 h后給藥（多糖終質量濃度為0～200 μg/mL），培養24 h后每孔加入10 μL H2O2溶液（終濃度800 μmol/L），繼續培養2 h，參照Yuzbasioglu等[22]的方法進行MTT檢測，結果見圖8。結果H2O2處理組細胞存活率為50.27%，如表6所示，各組分多糖對H2O2誘導的細胞損傷均具有一定的保護作用，而且呈現出濃度相關性。其中PNPS-0.3對氧化損傷的保護效果最好，在給藥質量濃度200 μg/mL時，其細胞存活率比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高了9.98%、32.29%（＜0.05）。

2.5.3 多糖對RW264.7細胞液抗氧化酶活性的影響 將RAW264.7細胞（2×104個/孔）接種到96孔板中。12 h后給藥（多糖終質量濃度為0、50、100、200 μg/mL），繼續培養24 h，再用H2O2（400 μmol/L）培養2 h。然后收集培養基上清液，參考Zhou等[23]的方法，測定細胞液中SOD、CAT、GSH- Px含量。結果細胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平分別為未處理組：（7.13±0.21）U/mL、（14.87±0.21）U/mL、（62.62±0.10）μmol/mL；H2O2處理組：（2.47±0.21）U/mL、（6.85±0.24）U/mL、（29.97±1.81）μmol/mL。

圖8 給藥24 h細胞狀態(比例尺40 μm)

表6 多糖對H2O2氧化損傷RAW264.7細胞保護作用(, n = 3)

如表7所示，多糖組分能顯著提升細胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平，減輕H2O2對RAW264.7細胞氧化損傷的程度[24]。抗氧化的效果表現為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0，并呈現明顯量效關系。質量濃度200 μg/mL時，PNPS-0.3處理組細胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平比PNPS-0.2組分別增加5.26%、7.42%、4.99%（＜0.05）；比PNPS-0組分別增加32.7%、15.76%、16.83%（＜0.05），說明其展現出良好的抗細胞氧化損傷能力。

表7 多糖組分對RAW264.7細胞液中SOD、CAT、GSH-Px含量的影響(, n = 3)

2.5.4 多糖對RAW264.7細胞氧化損傷保護的熒光定性及定量分析 參考Zhao等[25]的方法，采用“2.4.3”項方法處理細胞，隨后加入熒光紅染料，37 ℃孵育30 min，用PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定，并用DAPI染色10 min。然后使用激光共聚焦顯微鏡，在激發波長570 nm下觀察不同處理條件下的紅色熒光強度，以未處理（空白）組，H2O2處理（對照）組為參照，做定性分析。按照上述方法，細胞培養在黑色96孔板中，使用多功能酶標儀對不同處理條件下的細胞（激發波長570 nm，發射波長585 nm）進行熒光定量分析。采用熒光探針（紅色）標記H2O2[26]。結果顯示，經不同多糖處理后，紅色熒光強度：對照＞PNPS-0＞PNPS-0.2＞PNPS- 0.3＞空白（圖9），進一步證明多糖在H2O2誘導的細胞損傷中發揮著有效的保護作用。

進一步，通過定量分析可知（表8），PNPS-0.3在給藥質量濃度200 μg/mL時，熒光強度僅為Con組的27.43%，與Blank組無統計學差異，其相對熒光定量指標比PNPS-0.2、PNPS-0分別降低了17.84%、61.82%（＜0.05）。

圖9 各組分多糖對RAW264.7細胞氧化損傷保護的熒光定性分析(比例尺20 μm)

表8 各組分多糖對RAW264.7細胞氧化損傷保護的熒光定量分析(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05***＜0.001；與PNPS-0組比較：###＜0.001；與PNPS-0.2組比較：ΔΔΔ＜0.001

*< 0.05***< 0.001control group;###< 0.001PNPS-0 group;ΔΔΔ< 0.001PNPS-0.2 group

3 討論

隨著心腦血管疾病日益年輕化，三七藥材的用量也日益增加，但近年來，可供種植的道地產區日益缺少，加之其種植采收加工消耗大量人力物力，三七藥材的品質保證以及綜合利用刻不容緩，三七藥渣資源的二次開發利用對三七產業的延續至關重要[27]。如果能在三七皂苷生產線的下游搭建三七多糖的生產線，則既能實現三七原藥材-三七藥渣-藥渣提取物之間的質量傳遞[28-29]，使三七藥材的生物利用度達到最大化；又能對2種產品同時溯源藥 材[30-32]，同時保證三七皂苷、多糖兩者的品質，提高三七藥材的藥用價值。

三七作為大宗藥材，其多糖成分已經得到廣泛的研究。Feng等[33]的從三七根中提取分離得到2種新型多糖，均由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖4種單糖組成，研究表明這兩種多糖在體外表現出相對較低的抗氧化能力，但對秀麗隱桿線蟲的氧化應激有很強的保護作用。本課題組在前期的研究工作中提取分離得到1種三七多糖[34]，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖5種單糖組成，研究表明該多糖能提升小鼠體內SOD和GSH-Px含量，防止過氧化物的積累。本研究得出，經過醇溶劑和高溫提取皂苷后的藥渣，提取出的多糖仍具有抗氧化活性，說明醇提皂苷的過程不會影響三七藥材中三七多糖的活性。但提取得到的三七多糖單糖組成發生變化，這種藥材-藥渣之間的差異性值得深思。

本研究結果表明，三七藥渣中粗多糖的提取率約為3%。據研究統計，每年因皂苷提取所產生的三七藥渣約為1000 t，若處理不當，約有30 t以上的活性多糖被廢棄[34]。因此，對三七藥渣中活性成分進行資源回收和二次加工利用，對三七產業的可持續發展無疑具有重要意義。

多糖作為天然高分子化合物，其生物活性與w大小、官能團差異以及單糖的組成及連接方式有關[35-36]。尤其是多糖中的糖醛酸含量和w大小與其生理活性密切相關。Chen等[37]和He等[38]的研究均表明，有相似結構特性的2種多糖，隨著糖醛酸含量的增加，對活性氧清除能力也會增強。其原因在于：一方面，糖醛酸含量較高的組分中大量存在的羧基更易于激活異頭氫原子與自由基反應[39-40]；另一方面，糖醛酸可通過增加巨噬細胞血紅素加氧酶（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）以及抗氧化酶的表達，進而激活核因子-紅細胞2 p45相關因子2（Nrf2），刺激巨噬細胞表現出抗氧化特性[41-42]。You等[43]和Sun等[44]在對不同w多糖進行抗氧化對比研究時，得出位于較大w和較小w之間的多糖具有最強的抗氧化活性。一般來說，w在3000～100 000時多糖抗氧化活性最佳[45]。其可能歸因于w太大會導致活性位點不易暴露，從而限制其抗氧化活性；然而若是w太小，則存在的活性官能團太少，又會使抗氧化活性不佳[46-47]。

本研究從三七藥渣中分離純化得到3種單一組分多糖PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3。分析單糖組成可知，各多糖組分均含有-甘露糖、-鼠李糖、-葡萄糖、-半乳糖、-阿拉伯糖。PNPS-0幾乎不含有糖醛酸，w為29 152；PNPS-0.2和PNPS-0.3為酸性多糖，含有-半乳糖醛酸和-葡萄糖醛酸，w分別為173 876和104 201。其中，PNPS-0.3的糖醛酸含量最高，其含量比PNPS-0.2提高27.58%。因此，適中的w和更高的糖醛酸含量導致PNPS-0.3表現出優于PNPS-0.2和PNPS-0的抗氧化活性。本研究表明，在相同的質量濃度下，PNPS-0.3對不同種類的自由基均具良好的清除活性，且清除能力優于PNPS-0.2和PNPS-0。進一步在細胞水平上，本實驗也通過檢測細胞抗氧化酶指標和進行熒光分析，得到了相同的結果。

綜上所述，本研究以資源二次開發利用為切入點，對三七藥渣中的多糖資源進行了深入挖掘，明確了其抗氧化能力，并初步闡明了結構和活性之間內在關聯，可為中藥材資源可持續開發利用提供新的研究思路和研究視角。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Separation and purification of polysaccharides fromresidues and its antioxidant activities

CAO Yu-biao1, 2, SUN Liang-liang1, 2, YANG Ye1, 2, CUI Xiu-ming1, 2, QIU Bin3, WANG Cheng-xiao1, 2

1. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory of Sustainable Development and Utilization ofResources, Kunming 650500, China 3. School of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To separate and purify the main polysaccharide components fromresidues, analyze its monosaccharide composition and compare its antioxidant activities.The crude polysaccharides fromresidues (PNPS) were extracted by water extraction and alcohol precipitation, and separated and purified by DEAE Fast Flow anion exchange column and Sephadex G-50 column. The relative molecular mass was analyzed by HPGPC and the monosaccharide composition and primary structure were preliminarily identified by scanning electron microscope (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), HPLC of derivatizing method. The antioxidant capacity and the protective effect of polysaccharide components on oxidative damage of RAW264.7 cells were explored.Three polysaccharide components (PNPS-0, PNPS-0.2, and PNPS-0.3) were isolated and purified. There were differences in monosaccharide composition and proportion among the three: PNPS-0 was mainly composed of-glucose (52.28%) and-galactose (34.14%), PNPS-0.2 was mainly composed of-galactose (40.89%),-arabinose (19.38%) and-glucose (12.25%) and PNPS-0.3 was mainly composed of-glucuronic acid (40.43%),-galactose (22.61%) and-glucose (18.32%). The antioxidant results showed that PNPS-0.3 had the strongest total reducing ability, the highest scavenging activity on DPPH free radical, OH?free radical, ABTS free radical and superoxide anion free radical, and the protective effect on oxidative damage of RAW 264.7 cells was the best in a concentration dependent manner.Three polysaccharide fragments with antioxidant activity were obtained fromresidues. The antioxidant activity was closely related to the structure and composition of polysaccharide. Therefore, this study provides a new research idea for the secondary development and utilization ofresources.

(Burk.) F. H. Chen; polysaccharide; structure-activity relationship; monosaccharide composition; antioxidant; Chinese medicine residue; high performance gel permeation chromatography;-glucose;-galactose;-arabinose;-glucuronic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)01 - 0100 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.013

2022-07-02

國家自然科學基金項目（81760642）；國家自然科學基金項目（82060645）；云南省科技重大專項（202002AA100004-2）；云南省科技重大專項（202102AA310045）；云南省科技重大專項（202002AA1000056）；云南省應用基礎研究計劃面上項目（202101AT070099）

曹玉標（1993—），男，碩士研究生，研究方向為中藥生物活性成分。E-mail: 1500109072@qq.com

通信作者：邱 斌（1976—），男，碩士，正高級工程師，從事中藥質量控制研究。E-mail: yyqiubin@aliyun.com

王承瀟（1985—），男，副教授，碩士生導師，從事中藥資源的綜合開發和合理利用研究。E-mail: wcx1192002@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]