瑞香狼毒的化學成分研究

周 地，劉麗穎，周官紅，陳 剛，李 寧

瑞香狼毒的化學成分研究

周 地，劉麗穎，周官紅，陳 剛，李 寧*

沈陽藥科大學中藥學院，遼寧省重大慢病中藥創新藥重點實驗室，沈陽市中藥藥效物質研究與創新藥開發重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

對瑞香狼毒的主要活性二萜成分南香大環素進行化學成分研究。選用D101型大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、ODS及HPLC等多種色譜學方法進行分離純化，并運用波譜學技術對化合物進行結構鑒定，通過計算ECD光譜確定化合物的絕對構型。從瑞香狼毒根95%乙醇水提取物中分離得到3個化合物，分別鑒定為(?)-異狼毒素C（1）、芫花萜烷J（2）和狼毒愈創木酮D（3）。化合物1～3均為新化合物，其中，化合物1為雙黃酮類化合物，化合物2、3為萜類化合物。

瑞香狼毒；(?)-異狼毒素C；芫花萜烷J；狼毒愈創木酮D；絕對構型

瑞香狼毒L.為瑞香科（Thymelaeaceae）狼毒屬Linn. 多年生草本植物，又稱燕子花、斷腸草等[1-2]。狼毒屬植物10～12種，我國有臺灣狼毒Hayata ex Li和瑞香狼毒2種，主要分布于我國臺灣、北方各省及西南地區。瑞香狼毒作為傳統有毒中藥，其藥用部位主要為根，傳統功效為祛痰、消積、止痛，外敷可治疥癬。現代藥理研究表明，瑞香狼毒具有抗艾滋病病毒、抗腫瘤、抗結核、抗白血病、抗癲癇等多種活性[3-4]。

南香大環素是瑞香烷型二萜的典型代表。1976年，南香大環素首次從瑞香科近心格尼迪木(Meissn.) Engl.的乙醇提取物中分離得到[5-6]。后期研究發現，該化合物亦存在于瑞香狼毒中。南香大環素具有顯著的抗HIV、抗腫瘤等生物學活性，為瑞香狼毒中的主要活性成分之一。

本研究對瑞香狼毒根95%乙醇水提取物進行系統分離，以期發現更多活性較好的先導化合物。利用多種色譜分離手段（硅膠吸附柱色譜、大孔吸附柱色譜、開放ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、HPLC）和重結晶等，共分離得到3個新的單體化合物，分別鑒定為(?)-異狼毒素C [(?)- isochamaejasmenin C，1]、芫花萜烷J（genkwadane J，2）和狼毒愈創木酮D（stelleraguaianone D，3）。其中，化合物1為雙黃酮類化合物，化合物2、3為萜類化合物，結構見圖1。

圖1 化合物1～3的化學結構

1 儀器與材料

Bruker-ARX、Bruker-AV型核磁共振波譜儀（400、600 MHz）、micro TOF Q型質譜儀（瑞士Bruker公司）；Shimadzu LC-6AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Bio-Logic SAS MOS-500型圓二色光譜儀（法國Bio-Logic公司）；Perkin-Elmer 341MC型旋光儀（珀金埃爾默儀器上海有限公司）；D101型大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩吸附樹脂材料科技有限公司）；薄層色譜（200～300目）、柱色譜（200～300目）硅膠（青島海洋化工廠）；ODS填料（50 μm）、YMC-Pack ODS-A C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A C18制備柱（250 mm×10 mm，5 μm），日本YMC公司。

實驗所用瑞香狼毒為2016年8月采集于甘肅省慶陽市正寧縣，經沈陽藥科大學中藥鑒定教研室潘英妮教授鑒定為瑞香科瑞香狼毒L.的干燥根。標本（20160801）保存于沈陽藥科大學中藥學院天然藥物化學實驗室。

2 提取與分離

瑞香狼毒干燥根的藥材飲片（10 kg）經初步粉碎后，采用95%乙醇水加熱回流提取3次，每次3 h，合并提取液，濃縮得到總提取物2.64 kg，采用D101型大孔吸附樹脂經60%乙醇水溶液和95%乙醇水溶液2個梯度依次洗脫，分別得到2.26 kg和0.326 kg相應乙醇洗脫物。在60%乙醇水溶液洗脫流分中取出180 g浸膏進行常規硅膠色譜柱分離，洗脫劑為不同比例的二氯甲烷-甲醇（100∶0、5∶1、2∶1、0∶100），共得到4個流分（Fr. 1～4）。

Fr.1（9 g）經開放硅膠柱色譜分離，利用不同比例的石油醚-醋酸乙酯按照100∶0～0∶100的比例進行洗脫得到8個流分（Fr. 1-1～1-8）。將Fr. 1-4（323 mg）進一步利用ODS柱色譜分離，洗脫劑為甲醇-水，并由HPLC分離（流動相為甲醇-水90∶10）得到化合物3（2.3 mg，R＝23 min）。Fr. 3（26 g）經開放硅膠柱色譜分離，利用不同比例的二氯甲烷-甲醇按照100∶0→0∶100的比例進行洗脫得到10個流分（Fr. 2-1～2-10），將Fr. 1-8（350 mg）進一步利用ODS柱色譜分離，洗脫劑為甲醇-水，并由HPLC分離（流動相為甲醇-水95∶5）得到化合物2（4.7 mg，R＝36 min）。將Fr. 2-2（850 mg）進一步利用ODS柱色譜分離，洗脫劑為甲醇-水，并由HPLC分離（流動相為甲醇-水80∶20）得到化合物1（24.7 mg，R＝43 min）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色無定形粉末（甲醇）；[α]20 D?22.7 (0.5, MeOH)；三氯化鐵-鐵氰化鉀反應為陽性，提示其結構含有游離酚羥基。HR-ESI-MS給出準分子離子峰[M－H]?/: 555.129 2（理論值C31H23O10，555.129 7），確定其分子式為C31H24O10，計算其不飽和度為20。1H-NMR (600 MHz, Acetone-6) 中，H5.82 (2H, overlapped, H-6, 6), 5.97 (2H, overlapped, H-8, 8) 為2組典型的5,7-二羥基取代二氫黃酮A環和A環氫信號；H7.23 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 7.00 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5) 和H7.13 (2H, d,= 8.3 Hz, H-2, 6), 6.90 (2H, d,= 8.3 Hz, H-3, 5) 為2組二氫黃酮B環和B環AABB偶合系統氫信號；H4.96 (2H, brs, H-2, 2), 3.93 (2H, brs, H-3, 3) 為2組二氫黃酮C環和C環氫信號；H3.83 (3H, s, 4-OCH3) 為甲氧基氫信號。13C-NMR (150 MHz, Acetone-6) 中給出31個碳信號，包括2組二氫黃酮A環和A環的12個碳信號C164.0 (C-5), 95.9 (C-6, 6), 167.8 (C-7, 7), 97.2 (C-8), 165.4 (C-9, 9), 102.5 (C-10) 和C164.1 (C-5), 95.9 (C-6, 6), 167.8 (C-7, 7), 97.2 (C-8), 165.4 (C-9, 9), 102.6 (C-10)；2組二氫黃酮B環和B環12個碳信號C129.7 (C-1), 130.6 (C-2, 6), 115.1 (C-3, 5), 161.6 (C-4) 和C128.6 (C-1), 130.7 (C-2, 6), 116.5 (C-3, 5), 159.4 (C-4)；2組二氫黃酮C環和C環6個碳信號C81.9 (C-2), 48.6 (C-3), 196.4 (C-4) 和81.9 (C-2), 48.3 (C-3), 196.4 (C-4)；以及1個甲氧基碳信號C55.7 (4-OCH3)。根據化合物1的1D NMR譜圖推測化合物為瑞香科狼毒屬特征的雙二氫黃酮類化合物，并根據HSQC譜的相關信息對其碳氫數據進行了歸屬，見表1。

HMBC譜中，觀察到H3.83 (4-OCH3) 與C161.6 (C-4) 有遠程相關，提示甲氧基連接在B環的C-4位；NOESY譜中，H3.83 (4-OCH3) 與H7.00 (H-3, 5) 相關，進一步證明甲氧基連接在B環的C-4位，見圖2。該化合物H-2和H-2為寬單峰，提示H-2/H-3和H-2/H-3均為順式構型。

根據馮寶民[6]的研究總結，以DMSO-6、CD3OD和Acetone-6為氘代試劑時，該類型化合物H-3/H-3相對構型可通過2, 2, 3, 3位氫化學位移規律確定，當H-2/2''為5.30～6.20，H-3/3''為2.60～3.10時，H-3/H-3為順式構型；當H-2/2''為4.70～5.00，H-3/3''為3.30～3.90時，H-3/H-3為反式構型。根據以上規律，該化合物H-2/H-2化學位移為4.96，H-3/H-3化學位移為3.93，即H-3/H-3為反式構型。由此，確定化合物1相對構型，即H-2/H-3和H-2/H-3為順式構型，H-3/H-3為反式構型。進一步測試化合物1的ECD光譜，與計算ECD譜圖進行對比分析，確定化合物1的絕對構型為2, 3, 2, 3，見圖3。綜上，經檢索該化合物為一未經報道的新化合物，命名為(?)-異狼毒素C。

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR數據(600/150 MHz)

圖2 化合物1的關鍵HMBC和NOESY信號

圖3 化合物1的實測和計算ECD譜圖

化合物2：白色無定型粉末（甲醇）；[α]20 D＋4.8 (0.2, MeOH)；HR-ESI-MS給出準分子離子峰[M－H]–/: 655.347 8（理論值C37H51O10, 655.349 6），確定其分子式為C37H52O10，計算其不飽和度為12。該化合物的13C-NMR (150 MHz, CDCl3) 給出37個碳信號，其中1組末端雙鍵碳信號C146.5 (C-15), 111.3 (C-16)以及C48.1 (C-1), 36.1 (C-2), 79.0(C-3), 83.2(C-4), 77.5(C-5), 77.3(C-6), 77.2 (C-7), 36.4 (C-8), 81.8 (C-9), 52.4 (C-10), 35.7 (C-11), 38.1 (C-12), 84.4 (C-13), 85.1 (C-14), 19.0(C-17), 22.7 (C-18), 14.8 (19-CH3), 67.5 (C-20) 構成瑞香烷型二萜母核的20個特征碳信號，且C77.3(C-6), 77.2 (C-7) 表明C-6, C-7環氧結構氧化變成2個羥基。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 中，低場區給出1組末端雙鍵氫信號H4.98 (1H, s, H-16a), 4.88 (1H, s, H-16b)；4個連氧次甲基氫信號H4.10 (1H, d,= 6.0 Hz, H-3), 3.66 (1H, d,= 4.8 Hz, H-5), 4.43 (1H, s, H-7), 4.36 (1H, d,= 2.4 Hz, H-14)；1組連氧亞甲基氫信號H4.89 (1H, d,= 12.0 Hz, H-20a), 4.58 (1H, d,= 12.0 Hz, H-20b)；5個次甲基氫信號H2.48 (1H, m, H-1), 2.07 (1H, t,= 6.0 Hz, H-2), 2.33 (1H, d,= 1.2 Hz, H-8), 2.91 (1H, d,= 6.0 Hz, H-10), 2.89 (1H, t,= 7.2 Hz, H-11)；高場區給出3組甲基氫信號H1.75 (3H, s, 17-CH3), 1.46 (3H, d,= 7.2 Hz, 18-CH3), 1.04 (3H, d,= 7.2 Hz, 19-CH3)。上述氫信號為瑞香烷型二萜母核上氫信號。13C-NMR (150 MHz, CDCl3) 中，C119.8 (C-1) 提示該結構含有瑞香烷型二萜類化合物特征的原酸酯結構；C130.0 (C-1), 129.9 (C-2, 6), 128.6 (C-3, 5), 133.4 (C-4) 為苯甲酰氧基苯環碳信號；C167.3 (C-OBz) 為苯甲酰氧基羰基碳信號；1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 中，H8.07 (2H, d,= 7.8 Hz, H-2, 6), 7.46 (2H, t,= 7.8 Hz, H-3, 5), 7.58 (1H, t,= 7.8 Hz, H-4) 為苯甲酰氧基苯環氫信號；H0.77 (3H, d,= 6.6 Hz, H-10) 為側鏈上甲基氫信號。根據HSQC譜的相關信息對其碳氫數據進行了歸屬，見表2。

在HMBC譜中，觀察到H4.36 (H-14) 與C119.8 (C-1) 有遠程相關，提示該化合物含有原酸酯結構；H2.07 (H-2), 2.91 (H-10) 與C36.4 (C-9) 有遠程相關，H0.77 (H-10) 與C35.8 (C-8), 48.1 (C-1) 有遠程相關，提示長側鏈與母核C-1相連形成大環結構；H8.07 (H-14) 與C167.3 (C-OBz) 有遠程相關，H4.89 (H-20a), 4.58 (H-20b) 與C167.3 (C-OBz) 有遠程相關，H4.43 (H-7), 3.66 (H-5) 與C67.5 (C-20) 有遠程相關，提示苯甲酰氧基與C-20相連；NOESY譜中，H3.66 (H-5) 與H4.10 (H-3), 2.91 (H-10), 4.89 (H-20a), 4.58 (H-20b) 相關，H4.10 (H-3) 與H2.91 (H-10) 相關，提示H-3/H-5/ H-10/H-20為同側；H2.33 (H-8) 與H2.89 (H-11) 相關，提示H-18/H-8為異側；H4.36 (H-14) 與H1.75 (H-17) 相關，提示H-14/H-17為同側；H-14為2.4 Hz，提示H-14/H-8為同側；H-7為單峰，提示H-7/H-8為同側。該化合物與芫花萜烷C（genkwadane C）結構很相似，不同之處在于該化合物的碳譜數據為48.1 (C-1), 36.4 (C-9), 35.8 (C-8)，而芫花萜烷C為50.1 (C-1), 38.0 (C-9), 22.5 (C-8)，提示C-9構型發生了改變[7-8]，NOESY譜中H2.48 (H-1) 與H1.04 (H-19), 0.77 (H-10) 相關，H-8與H-18相關，H-9與H-10相關也進一步證明該化合物為芫花萜烷C在C-9位的異構體，詳見圖4。自然界中1位烷基化，且含有原酸酯結構的瑞香烷型二萜類化合物五元環與七元環為反式駢合，19-CH3為構型，由此確定該化合物的構型[7]。綜上，經檢索該化合物為1個未經報道的新化合物，命名為芫花萜烷J。

化合物3：白色粉末（甲醇）；HR-ESI-MS給出準分子離子峰[M＋H]+/: 235.164 3（理論值C15H23O2，235.169 8）；結合1H-和13C-NMR可確定其分子式為C15H22O2。化合物3的1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 在低場區給出1組末端雙鍵氫信號H4.73 (1H, m, H-13a) 和4.76 (1H, m, H-13b)；4組亞甲基氫信號H2.47 (1H, dd,= 19.3, 1.2 Hz, H-2α), 2.55 (1H, m, H-2β), 2.44 (1H, dd,= 19.3, 0.9 Hz, H-6α), 2.80 (1H, brd,= 19.3 Hz, H-6β), 1.42 (1H, m, H-8α), 1.89 (1H, m, H-8β), 1.88 (1H, m, H-9α), 2.02 (1H, m, H-9β)；2個次甲基氫信號H3.19 (1H, m, H-10), 2.37 (1H, brt,= 10.9 Hz, H-7)。在高場區給出3個甲基氫信號H0.95 (3H, brs, CH3-14), 1.66 (3H, d,= 0.9 Hz, CH3-15), 1.77 (3H, brs, CH3-12)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3) 譜中給出15個碳信號C208.3 (C-3), 138.4 (C-4), 172.2 (C-5), 150.4 (C-11), 109.6 (C-13), 74.8 (C-1), 52.0 (C-10), 46.7 (C-9), 43.9 (C-7), 37.6 (C-2), 37.8 (C-6), 32.0 (C-8), 20.4 (CH3-12), 21.0 (CH3-14), 8.3 (CH3-15)，提示其為愈創木烷型倍半萜類化合物，且其NMR數據與已知化合物狼毒愈創木酮A（stelleraguaianone A）類似[8]。

表2 化合物2的1H-NMR 和13C-NMR數據(600/150 MHz)

圖4 化合物2的關鍵HMBC和NOESY信號

HMBC譜中，觀察到H2.47 (H-2)與C138.4 (C-4)、172.2 (C-5) 有遠程相關，H2.80 (H-6β) 與C138.4 (C-4)、32.0 (C-8) 有相關，H2.37 (H-7) 與C46.7 (C-9)、172.2 (C-5) 有遠程相關，H3.19 (H-10) 與C37.6 (C-2)、C172.2 (C-5) 有遠程相關，H4.76 (H-13b)、1.77 (CH3-12) 與43.9 (C-7) 有遠程相關，進一步確定化合物3為愈創木烷型倍半萜骨架。H0.95 (CH3-14) 與C74.8 (C-1)、46.7 (C-9)有遠程相關提示CH3-14取代在C-10位，H1.66 (CH3-15) 與C208.3 (C-3)、172.2 (C-5) 有遠程相關提示CH3-15取代在C-4位，見圖5。與已知化合物狼毒愈創木酮A的NMR相比，化合物3多出1個次甲基氫信號，且C-10位的化學位移向高場位移，推測該化合物C-10位無羥基取代。由此，確定了該化合物的平面結構，NMR數據歸屬見表3。

化合物3的相對構型通過NOESY譜進行解析，H1.66 (CH3-15) 與H2.44 (H-6α), 2.37 (H-7)相關，提示C-4, 5的雙鍵為型。H3.19 (H-10) 與H2.37 (H-7) 相關，提示H-10和H-7為同側，NOESY譜中并未出現1-OH信號，但根據該類倍半萜的生源合成途徑推測1-OH和H2.37 (H-7)、3.19 (H-10) 在同側，經文獻檢索，化合物3為未見文獻報道的新化合物，鑒定為狼毒愈創木酮D。

圖5 化合物3的關鍵HMBC和NOESY信號

表3 化合物3的1H-NMR和13C-NMR數據(600/150 MHz)

4 結論

從瑞香狼毒中發現抗HIV活性化合物南香大環素的基礎上，進一步對瑞香狼毒提取物的有效部位進行系統分離，得到3個新化合物，分別屬于雙黃酮類化合物和萜類化合物，為該植物的進一步應用和研究提供了豐富的物質基礎，為更充分地實現其藥用價值提供科學依據，后續會繼續對從中分離的新化合物抗HIV活性進行生物評價。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from

ZHOU Di, LIU Li-ying, ZHOU Guan-hong, CHEN Gang, LI Ning

Liaoning Key Laboratory of Innovative Traditional Chinese Medicine for Major Chronic Diseases, Key Laboratory for TCM Material Basis Study and Innovative Drug Development of Shenyang City, School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

To systematically study the main active diterpenoids, gnidimacrin, chemical constituents of.D101 macroporous adsorption resin, silica gel column chromatography, ODS, HPLC and other chromatographic methods were used for separation and purification, and the compounds were identified by spectroscopic techniques. The absolute configuration of the compound was determined by ECD.Three compounds were isolated from. They were identified as (?)-isochamaejasmin C (1), genkwadane J (2) and stelleraguaianone D (3), respectively.Compounds 1—3 are new compounds, among which compound 1 is a biflavonoid and compounds 2 and 3 are terpenes.

L.; (?)-isochamaejasmenin C; genkwadane J; stelleraguaianone D; absolute configuration

R284.1

A

0253 - 2670(2023)01 - 0029 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.004

2022-11-07

遼寧省自然科學基金資助項目（2022-MS-242）；遼寧省教育廳科技項目（LJKZ0949，LJKZ0945）；沈陽市中青年科技創新人才計劃（團隊）項目（RC200408）

周 地（1993—），女，副教授，從事傳統中藥的活性成分研究。E-mail: zhoudi930322@163.com

通信作者：李 寧，教授，沈陽藥科大學中藥學院副院長，主要從事中藥、天然藥物藥效物質基礎和質量控制研究。Tel: (024)43520739 E-mail: liningsypharm@163.com

[責任編輯 王文倩]