煙草NtCBT基因啟動子酵母單雜誘餌載體構建及互作蛋白篩選

余婧 楊慧 余世洲 趙會納 鄭慶霞 王兵 雷波

（1.貴州省煙草科學研究院 煙草行業煙草分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081；2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001）

轉錄因子（transcription factors，TFs）是一類能特異識別并結合靶基因啟動子順式作用元件的蛋白質，可調控靶基因以特定的強度在不同時間或空間表達［1-3］。煙草類西柏烷是一類在煙草分泌型腺毛中特異合成及分泌的代謝物，主要為α-和β-西柏三烯二醇［4-5］，研究表明西柏三烯二醇具有抗病毒、神經保護等作用，在醫學領域具有潛在應用價值［5-6］。此外，栽培煙草經調制、陳化后，類西柏烷則進一步降解為茄酮等與煙草香氣密切相關的物質［4-5，7］。煙草類西柏烷的生物合成主要包括兩個步驟：（1）前體物質牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，由GGPP基因編碼）在西柏三烯一醇合酶（cembratrienol synthase，由CBT基因編碼）的催化下環化，生成α-和β-西柏三烯一醇［8-9］；（2）在細胞色素P450加氧酶（cytochrome P450 hydroxylase，由CYP71D16基因編碼）催化下，α-和β-西柏三烯一醇氧化生成α-和β-西柏三烯二醇［9-10］。雖然煙草類西柏烷生物合成途徑及相關結構酶基因已較為清楚，但有關分子調控機制的報道較少。

酵母單雜交（yeast one-hybrid，Y1H）是一項在酵母細胞內研究蛋白與核酸相互作用的技術，可通過酵母cDNA文庫的篩選，獲得與靶基因啟動子結合的蛋白質［11-13］，科研人員已采用該技術經識別并鑒定出許多與目的核酸序列相結合的蛋白質，余玉珍等［14］通過酵母單雜技術獲得了與甲基酶編碼基因（CYP82E4）啟動子相結合的鋅指蛋白轉錄因子，推測該蛋白通過調控CYP82E4的表達，進而影響煙草去甲基煙堿的合成。宋國琦等［15］構建了擬南芥球形胚時期種子的酵母文庫，并從中篩選到與胚柄特異基因G564啟動子相結合的22個結合蛋白。Spyropoulou等［16］為了鑒定番茄腺毛中調控萜烯生物合成的蛋白，將芳樟醇合成酶基因（SlTPS5）啟動子構建誘餌載體，并從番茄腺毛cDNA酵母文庫中篩選到與SlTPS5啟動子互作的轉錄因子SlEOT1。

為篩選與NtCBT基因啟動子結合的轉錄因子，解析煙草類西柏烷生物合成的分子調控機制，從栽培煙草K326基因組中克隆NtCBT基因的啟動子序列［17］，并將啟動子區域-612 - 0 bp、-499 - 0 bp序列構建誘餌載體進行酵母單雜自激活實驗，結果表明，二段序列均存在自激活現象（本研究未展示），不能進行下一步的酵母單雜篩庫實驗。為篩選出與NtCBT基因啟動子相結合的轉錄因子，本實驗將該基因起始密碼子ATG 5′端上游-929 - +10 bp區域進一步截為6個片段分別進行自激活實驗，并將沒有自激活的區域之一：P5（-279 - -119 bp）作為誘餌載體，從煙草腺毛cDNA文庫中篩選與NtCBT基因啟動子互作的結合蛋白，旨在為進一步挖掘及鑒定煙草類西柏烷合成途徑的調控基因、解析其合成的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 栽培煙草K326（Nicotiana tabacum L.）。

1.1.2 實驗試劑 酵母單雜交試劑盒Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Y1H Gold酵母菌、酵母轉化試劑盒Yeastmaker Yeast Tranformation System 2、酵母培養基、金擔子素（aureobasidinA，AbA）、酵母菌落PCR檢測試劑盒Matchmaker Insert Check PCR Mix 1購自美國Clontech公司；酵母質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶BstB I購自美國NEB公司；煙草腺毛cDNA酵母文庫于本實驗室保存，文庫庫容為2.6×106CFU；引物、基因合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 啟動子順式作用元件分析 采用在線網站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、PlantPAN3.0（http://plantpan.itps.ncku.edu.tw/）預測NtCBT基因啟動子中的轉錄因子結合 motif。

1.2 方法

1.2.1 pBait-AbAi重組誘餌載體構建 將NtCBT基因啟動子-929 - 10 bp分為6 個區域（P1 ：-929 --750 bp，P2 ：-769 - -590 bp ，P3 ：-609 - -430 bp，P4 ：-449 - -270 bp，P5 ：-279 - -119 bp，P6 ：-129 -10 bp），通過基因合成的方法，將目的片段構建成3個串聯重復，連接至酵母單雜誘餌載體pBait-AbAi，并將重組誘餌載體pAbAi-Px分別命名為 ：pAbAi-P1、pAbAi-P2、pAbAi-P3、pAbAi-P4、pAbAi-P5、pAbAi-P6。

1.2.2 誘餌載體線性化及轉化酵母Y1H Gold 參照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System說明書中的方法，采用內切酶BstB I分別將6個pAbAi-Px重組質粒單酶切線性化，將1 μg線性化后的質粒轉化到Y1H Gold酵母感受態細胞中，涂布SD/-Ura固體平板，30℃培養3-5 d后挑取單菌落，采用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1試劑盒進行PCR菌落反應，若擴增出一段約1.35 kb+X的片段，表明誘餌質粒成功整合到酵母Y1H Gold基因組中，即為誘餌菌株Y1H［pAbAi-Px］。

1.2.3 重組誘餌載體對AbA的敏感性 從SD/-Ura平板上挑取整合成功的酵母單菌落，用0.9% NaCl溶液懸浮菌落并將OD600調至0.002（即每100 μL中包含2 000個細胞），各取100 μL菌液涂布以下培養基：SD/-Ura、SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（500 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（800 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（1 000 ng/mL），30℃培養 3-5 d后觀察酵母菌落的生長情況，以確定各重組誘餌載體對AbA的敏感性。

1.2.4 酵母單雜交cDNA文庫篩選 取煙草腺毛cDNA酵母文庫質粒10 μg，按照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System的說明書進行酵母單雜篩庫實驗。在質粒導入酵母誘餌菌株后，取轉化后的重懸菌液150 μL，涂布到含有相應濃度AbA的SD/-Leu固體平板，30℃培養3-5 d，此時單克隆大小為1-2 mm，初篩完成；將初篩平板上長出的陽性克隆轉移到相同的篩選培養基，進行二次篩選。30℃培養3-5 d后，提取陽性克隆的質粒進行PCR反應，PCR產物送生物公司測序。

2 結果

2.1 pAbAi-Px重組誘餌載體自激活

采用BstB I將重組誘餌載體pAbAi-Px單酶切線性化，電泳結果如圖1所示，酶切成功的質粒電泳呈單一條帶，且條帶比未酶切的質粒條帶略大，說明6個載體均成功線性化。將線性化載體轉化Y1H Gold酵母菌感受態，鑒定為陽性后，取菌液涂布到含有相應濃度AbA的SD/-Ura平板，5個誘餌菌株Y1H［pAbAi-P1］-Y1H［pAbAi-P5］在 含 有 SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）的培養基上均不能正常生長（圖2），說明這5個誘餌菌株對AbA的敏感性為200 ng/mL。而對于Y1H［pAbAi-P6］誘餌菌株，當AbA濃度加至1 000 ng/mL時，仍不能抑制住酵母的生長（圖3）。重組誘餌載體pAbAi-P1-P5在200 ng/mL AbA的存在下無自激活，可采用這5個載體進行下一步的酵母單雜篩庫實驗；而Y1H［pAbAi-P6］誘餌菌株在含有1 000 ng/mL AbA的SD/-Ura平板上仍能生長，說明pAbAi-P6存在著強烈的自激活，不能用作酵母單雜篩庫的誘餌載體。

圖1 重組誘餌載體pAbAi-Px線性化Fig.1 Linearization of recombinant bait vector pAbAi-Px

圖2 pAbAi-Px誘餌載體自激活Fig.2 Self-activation of pAbAi-Px bait vector

圖3 pAbAi-P6誘餌載體自激活Fig.3 Self-activation of pAbAi-P6 bait vector

2.2 P5區域轉錄因子結合motif預測及pAbAi-P5重組誘餌載體PCR鑒定

選取構建好的pAbAi-P5誘餌載體做進一步的酵母單雜篩庫實驗，首先預測P5區域中的轉錄因子結合motif，結果如圖4所示，PlantCARE及Plant-PAN3.0均預測到P5區域中存在一個MYB轉錄因子結合的核心motif：CAGTTA；另外，PlantPAN3.0還預測到P5區域中存在著AP2/ERF轉錄因子結合motif：AGCTA、ATTTA；bHLH轉錄因子結合motif：ATGCGTGG、ATACGATT；以及HD-ZIP轉錄因子結合motif：CAATTATAG。按照2.1中的實驗，從SD/-Ura平板上挑取生長健康的Y1H［pAbAi-P5］單菌落，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1試劑盒進行PCR菌落反應，如圖5所示，擴增獲得一段約1.84 kb（1.35 kb+0.49 kb）片段，表明誘餌載體成功轉入酵母基因組，可以進行下一步的酵母單雜篩庫實驗。

2.3 酵母單雜交cDNA文庫篩選

將Y1H［pAbAi-P5］作為誘餌菌株，在煙草腺毛cDNA酵母文庫中篩選與NtCBT基因啟動子P5區域互作的結合蛋白。在SD/-Leu/AbA（200 ng/mL）平板的初篩中，共獲得50個1-2 mm的陽性酵母菌落（圖6，展示部分菌落），將這50個陽性克隆在相同培養基上進行二次點種篩選，最終獲得49個陽性克隆（圖7）。提取陽性克隆的酵母質粒，使用通用引物進行PCR反應，部分PCR結果如圖8所示，其片段長度在400-2 500 bp之間，隨后將PCR產物送公司測序。

圖6 NtCBT基因啟動子P5區域結合蛋白的初篩Fig.6 Preliminary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

圖7 NtCBT基因啟動子P5區域結合蛋白的二次篩選Fig.7 Secondary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

圖8 部分陽性菌落的PCR檢測Fig.8 Identification of partial positive colonies by PCR

2.4 陽性克隆測序和分析

將測序結果在NCBI上進行Blast比對，結果顯示，ID為XP_016475182.1的蛋白在陽性克隆測序結果中出現9次，該蛋白注釋為BURP domain protein RD22-like isoform X1；ID為 XP_019247962.1的蛋白出現7次，注釋為功能未知的蛋白。去掉多余及重復的基因，共獲得35個可能與NtCBT基因啟動子P5區域結合的蛋白，包括XP_009798273.1、XP_009780978.1等5個功能未知的蛋白，以及注釋 為 calcineurin B-like protein 10、protein BPS1，chloroplastic-like、GDP-L-galactose phosphorylase 1-like等27個蛋白。另外，還篩選到3個推定的轉錄因子，分別為HD-ZIP蛋白家族的ANL2（homeobox-leucine zipper protein ANTHOCYANINLESS 2-like isoform X2，XP_009602857.1）、ML1（homeobox-leucine zipper protein MERISTEM L1-like，XP_009799795.1） 以 及NF-Y蛋白家族的NF-YA3（nuclear transcription factor Y subunit A-3-lik，XP_016441195.1），這3個轉錄因子可能與NtCBT基因啟動子的P5區域存在著潛在的結合關系。

3 討論

通過酵母單雜交cDNA文庫篩選通常可獲得與靶基因啟動子結合的蛋白質，進一步分析獲得候選轉錄因子［11］。對煙草類西柏烷生物合成途徑中的結構酶基因CBT、CYP71D16已有廣泛的研究［5，9-10］，然而，有關該途徑的調控基因及分子調控機制研究較少，為了獲得調控煙草類西柏烷生物合成的轉錄因子，將NtCBT基因啟動子截為6個區域并分別進行酵母單雜誘餌載體自激活實驗，結果表明，除P6區域外，另外5個區域（P1-P5）在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板中均無自激活現象。根據Ennajdaoui等［9］在林煙草中的實驗，CBT基因啟動子中的P5區域（-279 - -119 bp）是決定CBT基因在煙草腺毛特異表達的關鍵區域，但與之結合的蛋白未知，因此，選擇P5區域進行酵母單雜篩庫實驗。經篩選，獲得3個轉錄因子，分別是HD-ZIP以及NF-Y蛋白家族成員。在對NtCBT基因啟動子P5區域的轉錄因子結合motif進行分析時，預測到MYB、AP2/ERF、bHLH、HD-ZIP轉錄因子可通過CAGTTA、AGCTA、ATGCGTGG、CAATTATAG 等motif結合到P5區域上，然而，在我們的篩庫結果中，僅篩到了HD-ZIP蛋白成員，以及一個沒有預測到的NF-Y蛋白，轉錄因子MYB、AP2/ERF及bHLH在本次篩庫中沒有篩到，這可能是在酵母單雜篩庫實驗中，存在著一定程度上的漏篩［3］。另外，在我們的實驗中，NtCBT基因啟動子的P1-P4四個區域在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板上均無自激活現象，進一步可將這4個誘餌載體從文庫中篩選與NtCBT基因啟動子相結合的其它轉錄因子。

M：Marker；泳道1，2：菌落PCR擴增產物M：Marker.Lane 1 and 2：PCR-amplified products

本次篩庫獲得的ANL2、ML1蛋白均屬于HDZIP轉錄因子的IV亞家族成員，主要參與表皮細胞分化、角質的生物合成、表皮細胞花青素積累，如擬南芥ANL2基因跟表皮層中花青素的組織特異性積累有關［18］，番茄的CD2是ANL2的同源基因，參與表皮角質層蠟的生物合成［19］；棉花GbML1基因在擬南芥中表達后影響表皮毛的數量及花青素的積累［20］。NF-YA3屬于NF-Y轉錄因子的NF-YA亞家族成員［21］，參與植物開花的分子調控［22］、果實成熟及糖分積累［23-24］、以及響應生物及非生物脅迫等生物學功能［21］。然而，目前未見相關報道說明這些轉錄因子是否參與了煙草類西柏烷合成的表達調控。鑒于篩庫結果，推測3個轉錄因子ANL2、ML1、NF-YA3可能與NtCBT基因啟動子相結合，調控NtCBT基因的表達，進而參與煙草類西柏烷的生物合成，下一步需要過表達、干涉表達等實驗驗證其功能。

4 結論

通過煙草腺毛單雜交cDNA文庫篩選，獲得3個與NtCBT基因啟動子P5區域相結合的轉錄因子，分別是HD-ZIP蛋白家族的ANL2、ML1以及NF-Y蛋白家族的NF-YA3，這3個轉錄因子可能通過調控煙草NtCBT基因的表達進而參與類西柏烷的生物合成過程。