α-鵝膏毒肽誘導肝細胞毒性作用機制的研究進展

許 悅，王 嬋，林紓丞，張慧潔，澹 憶，張樹威，曾曉鋒，李 楨

（昆明醫科大學法醫學院，云南 昆明 650500）

在全球范圍內，每年野生菌中毒造成約數百人死亡，數千人需要醫療救助，國內頻發野生菌中毒事件，其中90%以上中毒死亡事件由鵝膏毒肽類野生菌引起[1]。云南省作為我國的野生菌大省，占有全國三分之二的野生菌資源，野生菌中毒在云南省食源性疾病、食物中毒發生和死亡中占主要原因[2]。鵝膏毒肽從胃腸道吸收，經門靜脈運至肝臟，肝細胞毒性主要歸因于α-鵝膏毒肽在肝臟中通過腸肝循環積累，臨床癥狀主要表現為急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）。鵝膏毒肽類野生菌中毒包括4 個階段：（1）潛伏期：潛伏期長是肝損害型中毒主要特征之一；（2）胃腸期：以惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛和血尿為特征；（3）假愈期：癥狀消失，出現看似好轉的現象，此階段α-鵝膏毒肽與核內RNA 聚合酶Ⅱ結合并破壞蛋白合成；（4）內臟損害期：出血、抽搐和暴發性肝衰竭發生，導致昏迷和死亡[3-5]。鵝膏毒肽類野生菌中毒引起的高發病率和死亡率已成為重要的全球公共衛生健康問題，文章主要從α-鵝膏毒肽中毒機制和治療相關方面進行綜述。

1 α-鵝膏毒肽

α-鵝膏毒肽是一種強大的天然肝毒素，屬于從致命鵝膏菌中分離出的雙環八肽，由至少9種不同化合物組成。它的雙環八肽結構包含2 個氧化氨基酸即：反式4-羥基脯氨酸（hydroxy proline，Hyp）和（2S、3R、4R）-4、5-二羥基異亮氨酸（dihydroxyisoleucine，DHIle），這是其毒性的關鍵[6-7]。α-鵝膏毒肽的毒性還與其化學結構密切相關，有無S=O 鍵、環肽結構及整體空間結構變化都會影響其毒性，作為一種耐熱因子，其具有熱穩定性，不會因煮沸、烹飪、干燥、蒸或冷凍而失去生物學活性[8]。目前研究表明，α-鵝膏毒肽的主要靶器官是肝臟，它經胃腸道吸收至門靜脈循環入肝后發揮其毒性作用。RNA pol Ⅱ被抑制后肝細胞的蛋白質合成再生能力被破壞，隨后發生小靜脈中心和門靜脈周圍出血性肝壞死，肝損傷生物標志酶-血清轉氨酶迅速增加，導致肝臟的不可逆損傷[9]。依據氨基酸組成及其結構的不同，將鵝膏肽類毒素分為鵝膏毒肽（Amatoxins）、鬼筆毒環肽（Phallotoxins）和毒傘素（Virotoxin），這3 類都是環化小分子。毒傘素無對人有害的證據，鬼筆毒環肽為速發毒性，而鵝膏毒肽為遲發毒性[10]。鵝膏毒肽又稱毒傘肽，根據側鏈取代基團的不同分為α-鵝膏毒肽（αamanitin）、β-鵝膏毒肽（β-amanitin）、γ-鵝膏毒肽（γ-amanitin）等。近年來，鵝膏毒肽相關研究主要集中在α-鵝膏毒肽，主要從灰花紋鵝膏、淡紅鵝膏、致命鵝膏、假淡紅鵝膏等有毒鵝膏菌中檢出[11]。在有毒鵝膏菌中，平均毒素濃度從菌蓋到菌柄再到菌托呈下降趨勢，不同鵝膏毒肽的平均毒素濃度從α-amanitin ＞ phallacidin ＞ βamanitin ＞ γ-amanitin 依次下降[12]。α-鵝膏毒肽是原代毒素，含有α-鵝膏毒肽的鵝膏菌是導致大多數野生菌中毒的主要原因，通過與RNA 聚合酶II 不可逆地結合而損害肝臟，在腸腔內被快速吸收，通過牛磺膽汁酸鈉共轉運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）途徑被轉運到至肝細胞膜上通過有機陰離子轉運多肽（organic anion transport polypeptides，OATP）進入肝臟，之后借助于腸肝循環造成α-鵝膏毒肽對肝臟的直接毒性作用，產生廣泛的中心葉壞死并導致急性肝衰竭。

2 α-鵝膏毒肽抑制肝細胞RNA 聚合酶Ⅱ活性

RNA 聚合酶II 是轉錄真核蛋白編碼基因以產生mRNA 的中心酶，α-鵝膏毒肽是公認的RNA聚合酶II 特異性抑制劑。α-鵝膏毒肽與RNA 聚合酶II 的最大亞基Rpb1 高親和力結合并抑制RNA 鏈延伸步驟的轉錄，它含有的非典型氨基酸殘基二羥基異亮氨酸[Ile（OH）2]、羥基脯氨酸（Hyp）和羥基色氨酸[Trp（OH）]，是其發揮毒性作用及對RNA 聚合酶II 高親和力的關鍵[7]。抑制轉錄是由于α-鵝膏毒肽直接干擾觸發環（trigger loop，TL）1 085 位置的組氨酸殘基[13]，觸發環是一種可移動的元件，通過折疊以催化RNA 鏈的延伸，對于催化后核酸易位到下一個DNA 模板位置至關重要，蛋白質合成依賴的肝臟再生能力被破壞，引起肝細胞的壞死改變[7]。藥代動力學表明α-鵝膏毒肽隨膽汁酸的腸肝循環到達肝臟直接與RNA 聚合酶II 不可逆結合，作用肝細胞核，并抑制其干擾DNA 和RNA 易位的活性導致肝細胞死亡[14]。α-鵝膏毒肽誘導OATPs 轉運體損傷，OATPs 屬于有機陰離子脂溶性載體多肽超家族，能介導藥物及內源性物質的轉運，其中OATP1B1 和OATP1B3 在肝臟中高表達，位于肝細胞的基底側，在肝臟的藥物攝取過程中起到很重要的作用[15]。在血液中的鵝膏毒肽通過肝竇細胞膜上的有機陰離子轉運多肽OATP1B3 及肝細胞膜上48 000 和53 000 的2 個載體蛋白系統進入肝細胞[10,16]。由于其對RNA 聚合酶II 的高選擇性抑制，α-鵝膏毒肽進入細胞后可抑制肝細胞的增殖和附著，這與其強毒性直接相關[17]。因此，隨著mRNA 水平的降低，蛋白質合成減少，高周轉率的細胞，如肝細胞、GIS 上皮細胞和肝小管細胞的蛋白質合成受阻，最終導致肝細胞死亡[18]。近來，研究發現利用α-鵝膏毒肽結構抑制劑來避免RNA 聚合酶Ⅱ失活，也不能緩解存活動物的晚期死亡情況，也就表明α-鵝膏毒肽對RNA 聚合酶Ⅱ的占位性抑制并不是其損傷肝細胞的唯一路徑[19]。

3 α-鵝膏毒肽誘導肝細胞凋亡和自噬

細胞凋亡是細胞死亡的一種基因控制機制，對正常發育過程中消除不需要的細胞和維持組織穩態至關重要，α-鵝膏毒肽可通過誘導細胞凋亡導致肝細胞損傷，且α-鵝膏毒肽誘導肝細胞凋亡主要通過線粒體凋亡途徑發生[20]。Arima 等[21]研究表明，α-鵝膏毒肽抑制RNA 聚合酶Ⅱ介導的mRNA 轉錄可誘導P53 依賴的細胞凋亡，引起促凋亡基因Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 的表達改變，從而激活了半胱氨酸蛋白酶級聯途徑，RNA 聚合酶Ⅱ被抑制所引起的轉錄受阻和蛋白降解導致抑癌基因P21Cip1 下調，P53 積累增多并易位至線粒體促進細胞色素C 的釋放，促使細胞進入S 期，隨后發生凋亡。α-鵝膏毒肽能誘導小鼠肝細胞發生凋亡，并在一定劑量范圍內有劑量依賴性和時間依賴性效應，肝細胞凋亡率隨劑量的增大和作用時間延長而增加[22]。Jan Magdalan 等[23]在犬類肝細胞中進行實驗研究證明，α-鵝膏毒肽引起的細胞毒性不僅會導致肝細胞死亡，還可導致肝細胞發生凋亡，且肝細胞的存活能力與α-鵝膏毒肽的濃度、α-鵝膏毒肽暴露時間之間有明顯的相關性。研究表明，α-鵝膏毒肽可與內源性細胞因子協同作用，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α），產生細胞損傷并誘導細胞凋亡[5]，細胞凋亡參與α-鵝膏毒肽肝細胞損傷發病過程，尤其在中毒早期階段。肝細胞染色質組織的紊亂是細胞核中的α-鵝膏毒肽引起的第一個變化，還可出現核仁分散，形成的顆粒團簇分散在整個核內[24]。與凋亡不同，自噬是一個主動的細胞保護過程，它是吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，借此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[25]。Chen X 等[26]研究表明，α-鵝膏毒肽可誘導L-02 細胞發生自噬，主要表現在LC3-II 蛋白水平的增加和p62 蛋白水平的逐漸降低上，增加給藥劑量后，LC3-II 蛋白水平先增后降，p62 蛋白水平先降后增。α-鵝膏毒肽給藥后小鼠體內的海藻糖表達顯著降低以及L-02 細胞中LC3-II和p62 蛋白水平的波動均表明自噬參與L-02 細胞損傷過程，上述實驗結果提示自噬參與了α-鵝膏毒肽中毒后肝細胞受損線粒體的清除過程[26]。Gu X 等[27]研究表明，自噬對α-amanitin 誘導Hepa1-6 肝癌細胞凋亡有促進作用，且該過程與ROS 無關。自噬對細胞有著雙向調節作用，適度自噬對細胞起著保護作用，過度自噬可造成細胞自噬性死亡，LC3-II 和p62 蛋白隨著α-鵝膏毒肽給藥劑量增加呈現波動性變化使得我們開始思考自噬在隨著給藥劑量增加的同時是否還具備主動保護和維持細胞穩態的作用。

4 α-鵝膏毒肽誘導肝細胞炎癥

肝臟作為最大的消化腺，易受到各種由代謝物、毒性物質、微生物等引起的損傷，導致肝細胞死亡并誘導炎性細胞募集，誘發炎癥反應[28]。曹玫等[29]在小鼠動物模型中尾靜脈注射LD50（0.327 mg/kg）劑量α-鵝膏毒肽后病理學組織發現小鼠肝細胞脂肪變性，肝臟充血、溶血，肝細胞呈氣球樣變，肝小葉內有炎性細胞浸潤，肝臟局灶性壞死；病變嚴重者可見大量炎細胞浸潤，形成細胞結節，壞死面積增大。研究發現，α-鵝膏毒肽可誘導肝細胞顯著炎癥反應，在小鼠體內實驗中肝臟免疫組化切片顯示NF-κB 易位細胞核；與空白組相比，α-鵝膏毒肽組激活核NF-κB 陽性表達顯著增加；在體外實驗α-鵝膏毒肽致L-02 細胞毒性模型中檢測NF-κB、p-NFκB、IκB-α、p-IκBα 蛋白表達，IκBα 及其磷酸化狀態對于NF-κB 的激活或抑制以及經典信號通路的傳導至關重要，p-NFκB 水平隨著時間的推移而顯著增加，α-鵝膏毒肽也誘導了L-02 細胞中IκB-α 的磷酸化[26]。

5 α-鵝膏毒肽誘導肝細胞氧化應激

氧化應激被定義為活性氧（reactive oxygen species，ROS）與抗氧化之間能力平衡的損害，它是大多數中毒類型中常見的病理生理途徑。Antoaneta Z 等[30]研究發現ROS 負荷增加和氧化應激參與了α-鵝膏毒肽引起的肝細胞毒性過程，并提出了自由基反應導致嚴重的α-鵝膏毒肽肝毒性的假設，隨后證實自由基中間體及ROS 的產生增多加重α-鵝膏毒肽導致的肝細胞毒性。Zerrin D 等[31]研究證明，氧化應激是α-鵝膏毒肽誘導肝毒性的原因，在這項實驗研究中，通過評估三種不同水平的小鼠α-鵝膏毒肽模型中氧化應激標記（SOD、CAT、GPx、MDA、TOS 和TAS）的趨勢，證實氧化應激在α-鵝膏毒肽毒性作用中占有重要地位，對多器官顯示出毒性作用，尤其是肝臟和腎臟。研究表明，α-鵝膏毒肽相關損傷與活性氧種類之間存在關系，α-鵝膏毒肽可以增多自由基中間體的轉化，增加活性氧的產生，如過氧化氫、超氧化物和羥基的產生，這是導致肝細胞膜損傷的主要原因[32-33]。Chen X等[20]研究結果表明，α-鵝膏毒肽誘導的細胞凋亡主要通過線粒體凋亡途徑發生，并與氧化損傷有關，L-02 細胞總反應氧和線粒體反應氧（ROS）水平隨時間的增加而增加，ROS 是一種參與α-鵝膏毒肽誘導小鼠肝細胞和L-02 細胞凋亡的上游信號分子。

6 藥物對α-鵝膏毒肽誘導肝細胞毒性的干預作用

6.1 N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸是一種具有自由基清除作用的半胱氨酸的乙酰基衍生物，是人體內還原型谷胱甘肽的前體物質，其主要經肝臟和腸道代謝，同時還能預防DNA 損傷、調節細胞的代謝活性、調整基因的表達和信號轉導，抗血管生成、抗細胞凋亡等作用[34]。N-乙酰半胱氨酸是一種公認的谷胱甘肽前體，對肝細胞具有保護作用，在α-鵝膏毒肽誘導肝細胞毒性中，N-乙酰半胱氨酸可清除自由基，具體效果依賴于肝臟谷胱甘肽的復制，起到抗炎、抗氧化作用[35]。維生素C、維生素E、西咪替丁、硫代酸等藥物具有直接和間接的抗氧化作用，但不具有特定的組織取向性，因而很少用于α-鵝膏毒肽的中毒治療[36]。

6.2 水飛薊賓

水飛薊，又稱奶薊，是一種優良的護肝植物，一種黃銅木質素類混合物，水飛薊賓是奶薊種子中主要活性成分[37]。水飛薊賓具有清除自由基、維持細胞膜穩定性、抗脂質過氧化、降血脂等藥理活性，它可以促進肝細胞再生，改善肝功能，具有較強的肝臟保護作用，臨床上常用來治療肝纖維化、非酒精性脂肪肝、酒精性肝病等肝損傷疾病[38]。α-鵝膏毒肽中毒最有效的臨床解毒劑是水飛薊賓，它可以抑制位于肝細胞膜上OATP1B3 和NTCP 對α-鵝膏毒肽的攝取，同時在氧化應激條件下具有清除自由基和抑制脂質過氧化、穩定膜結構和保護酶等抗氧化作用[10]。水飛薊賓對α-鵝膏毒肽所致的受損肝細胞起到保護和促進細胞增殖的作用，作為一種具有肝保護特性的解毒劑，水飛薊賓減低了自由基的產生，抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）的釋放，刺激受損肝細胞的蛋白質合成[39]。

6.3 多粘菌素B

多粘菌素B 作為窄譜抗菌藥物，從多粘類芽孢桿菌中分離而來，對大多數革蘭氏陰性菌均有較好的抗菌活性[40]。α-鵝膏毒肽的主要毒性機制（即抑制RNA polⅡ活性），理想的治療方法是取代α-鵝膏毒肽與RNA polⅡ結合而不影響其正常轉錄活性的競爭，多粘菌素B 被證明可以在α-鵝膏毒肽同一位點與RNA polⅡ結合，阻止毒素與RNA polⅡ結合，多粘菌素B 不僅對基因表達有強烈的影響，而且對α-鵝膏毒肽誘導肝細胞損傷有明顯的保護[41]。Juliana G 等[36]研究發現，在小鼠體內多粘菌素B 有效地恢復了腎臟中α-鵝膏毒肽誘導的mRNA 轉錄抑制；組織學和肝轉氨酶血漿數據均提示多粘菌素B 顯著降低肝和腎中α-鵝膏毒肽誘導的細胞損傷；生存實驗研究發現所有暴露于α-鵝膏毒肽的動物在5 d 內死亡，而在服用α-鵝膏毒肽4、8 和12 h 后給予多粘菌素B，動物50%存活到30 d。

6.4 青霉素G

青霉素G 是一種常用抗生素，主要作用于革蘭氏陽性菌，常為抗菌藥物的首選。α-鵝膏毒肽的流入是由OATP 的一種亞型介導的，其中OATP1B1 和OATP1B3 是攝取的關鍵轉運體，青霉素G 因其可抑制OATP1B3 攝取轉運體向肝細胞內轉運α-鵝膏毒肽而起到肝臟保護作用而被廣泛應用于鵝膏毒肽中毒治療[16]。

6.5 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種含有多酚結構化合物，它主要存在于紅葡萄，花生、松樹、豆類等植物中，是一種生物活性很強的多酚類物質，常被用于藥物和毒素引起肝毒性相關研究[42]。近年研究表明，白藜蘆醇可以保護肝臟，對抗膽汁淤積、藥物和酒精誘導的損傷，白藜蘆醇因其具有抗氧化、抗炎作用而被用于α-鵝膏毒肽的中毒治療中[43]。

α-鵝膏毒肽是大多數致命鵝膏菌發揮毒性作用的關鍵，中毒后沒有普遍接受的解毒劑或標準化治療方法，治療通常包括重癥支持性護理，液體和電解質不平衡、凝血障礙和低血糖等[44]。α-鵝膏毒肽嚴重中毒可導致急性肝功能衰竭，中毒治療常使用治療急性肝衰竭的標準治療方法。由于缺乏特異性解毒劑，早期的胃腸道毒物清除及胃腸炎期治療及診斷就顯得尤為重要。臨床使用N-乙酰半胱氨酸、水飛薊賓、青霉素G 進行抗氧化治療及抑制OATP1B3 對α-鵝膏毒肽的攝取來減輕肝細胞毒性損傷。發展至肝衰竭期需進行保肝、血漿置換、排毒和清除代謝產物、預防肝性腦病等治療，肝移植也就成為α-鵝膏毒肽中毒后肝衰竭的最有效解救方法。

7 小結

野生菌中毒是影響公眾健康最突出的公共衛生問題之一，鵝膏毒肽中毒會引起以急性肝衰竭為主要特征的一種疾病，病程進展快，病死率高。目前，α-鵝膏毒肽中毒第一階段的非特異性癥狀使得中毒的診斷及治療變得不同，很大程度限制了治療措施的有效性，對于α-鵝膏毒肽致肝細胞毒性的機制缺乏基礎研究，仍待進一步明確。近年來，α-鵝膏毒肽相關研究更多集中在代謝組學，毒理學機制方面的研究仍待進一步完善，如α-鵝膏毒肽誘導肝細胞氧化應激、凋亡、炎性反應、自噬的作用途徑尚未完全闡明，這也就意味著需要更多的實驗數據支撐，在一定程度上為筆者提供了研究方向。文章對α-鵝膏毒肽誘導肝細胞毒性作用機制及相關治療藥物進行了綜述，α-鵝膏毒肽通過誘導肝細胞發生氧化應激、凋亡、炎性反應及自噬等在肝細胞毒性中起到一定的作用，通過抑制RNA 聚合酶II 造成蛋白合成受阻，從而細胞壞死，加重損傷引起急性肝衰竭。中毒后治療主要包括使用N-乙酰半胱氨酸、水飛薊賓、青霉素G、多粘菌素B、白藜蘆醇、血漿置換及肝移植等進行相關抗炎、抗氧化、保肝等治療。文章通過對α-鵝膏毒肽肝細胞毒性作用機制及相關治療藥物作用機制的總結，為后續α-鵝膏毒肽相關治療藥物研發提供一定的理論依據。