一測(cè)多評(píng)法對(duì)金鈴子散中來(lái)源于延胡索的5個(gè)生物堿成分含量的同時(shí)測(cè)定*

任慧，崔小敏，胡靜，劉小妹，陳志永

陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003

金鈴子散是治療肝郁血滯、氣郁化火的名方，金元時(shí)期劉完素《素問(wèn)·病機(jī)氣宜保命集篇》中記載：“治熱厥心痛，或發(fā)或止，久不愈者，當(dāng)用金鈴子散。金鈴子，玄胡各一兩，上為細(xì)末，每服三錢(qián)，酒調(diào)下。”［1］方中金鈴子（川楝子）和玄胡（延胡索）以1∶1配伍，川楝子疏肝行氣，清泄肝火；延胡索行氣活血，尤長(zhǎng)于止痛，以增強(qiáng)川楝子止痛之功［2］。現(xiàn)代臨床實(shí)踐中金鈴子散主要用于治療慢性肝炎、膽囊炎、膽石癥、肝硬化、胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎等疾病［3-4］。藥理學(xué)研究表明，醋炙延胡索和炒川楝子配伍鎮(zhèn)痛抗炎作用尤佳［5］，而其散劑鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)于湯劑［6］。

目前，對(duì)復(fù)方的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)可通過(guò)對(duì)多個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定實(shí)現(xiàn)，而多指標(biāo)評(píng)價(jià)導(dǎo)致對(duì)照品消耗大，制約了中藥制劑中多成分含量測(cè)定方法研究，而一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS）是利用中藥中有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，選擇一個(gè)廉價(jià)易得的有效成分為內(nèi)參物，通過(guò)測(cè)定內(nèi)參物的含量實(shí)現(xiàn)多成分同時(shí)測(cè)定，該法是一種快速、簡(jiǎn)便，且符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，近年來(lái)在中藥質(zhì)量控制中被廣泛應(yīng)用［7］。本研究以延胡索乙素為內(nèi)參物，首次建立了金鈴子散中來(lái)源于延胡索的延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿5種生物堿成分的一測(cè)多評(píng)質(zhì)量控制方法，旨在提供一種快速、簡(jiǎn)便實(shí)現(xiàn)金鈴子散中生物堿類(lèi)成分含量測(cè)定的方法，提高金鈴子散質(zhì)量控制水平，為金鈴子散的有效性、安全性提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；SHIMADZU 2010A-HT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG-16WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南邁克爾儀器有限公司）；BS210S型和BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 試藥炒川楝子（產(chǎn)地：四川，規(guī)格：1.0 kg，批號(hào)：20180601、20190301）、醋延胡索（產(chǎn)地：陜西，規(guī)格：1.0 kg，批號(hào)：20181001、20190701）均購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司；炒川楝子（編號(hào)：CLZ20181201）、醋延胡索（編號(hào)：YHS20180801）購(gòu)于西安市老百姓大藥房，并經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員鑒定為正品；延胡索乙素對(duì)照品（純度99.86%，批號(hào)：MUST-18032720）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；鹽酸巴馬汀對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：18082103）、鹽酸黃連堿對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：19042602）均購(gòu)于上海圻明生物科技有限公司；去氫紫堇堿對(duì)照品（純度≥97%，批號(hào)：CHB170220）、紫堇堿對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：CHB171107）均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；水為超純水，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～90 min，16%～24%乙腈），柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL。在本色譜條件下，金鈴子散中5種成分分離度良好，陰性樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 各溶液高效液相色譜圖

2.2 金鈴子散制備按照金鈴子散處方比例稱(chēng)取不同批次炒川楝子、醋延胡索藥材，粉碎，過(guò)60目篩，制備3批次制劑，編號(hào)分別為20191106、20191107、20191108。

2.3 供試品溶液制備精密稱(chēng)取金鈴子散制劑2.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇30 mL，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，取1 mL提取液以離心半徑6.3 cm，5000 r/min離心5 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 混合對(duì)照品溶液制備分別稱(chēng)取延胡索乙素、鹽酸黃連堿、紫堇堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇水溶液溶解，配制成含延胡索乙素（128.0 μg/mL）、鹽酸黃連堿（48.0 μg/mL）、紫堇堿（46.0 μg/mL）、鹽酸巴馬汀（25.6 μg/mL）、去氫紫堇堿（103.2 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液。

2.5 陰性樣品溶液制備精密稱(chēng)取川楝子藥材，按照“2.2”項(xiàng)下金鈴子散制備工藝制備陰性制劑，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.6 線(xiàn)性范圍考察分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。各待測(cè)成分回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)生物堿成分的線(xiàn)性關(guān)系

2.7 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.6”項(xiàng)下同一份混合對(duì)照品溶液，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算得延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿峰面積的RSD分別為0.81%、1.41%、1.33%、1.31%、1.76%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取同一批金鈴子散制劑（批號(hào)：20191106）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定5種待測(cè)成分的含量，并計(jì)算各待測(cè)成分含量的RSD值，結(jié)果延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿的RSD分別為2.92%、2.35%、1.84%、2.29%、2.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿峰面積的RSD分別為0.92%、0.94%、0.42%、1.90%、0.88%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知5個(gè)化合物含量的金鈴子散樣品（批號(hào)：20191106）1.0 g，共6份，分別精密加入各對(duì)照品適量，依據(jù)“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法及“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各待測(cè)成分的加樣回收率及RSD值，結(jié)果5個(gè)生物堿平均加樣回收率為96.79%～102.41%，RSD為0.45%～2.67%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.11 相對(duì)校正因子計(jì)算參考文獻(xiàn)方法，采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對(duì)校正因子（fs/i）［8］，即以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fs/i取平均值作為定量用的fs/i，計(jì)算公式［9］為：

公式（1）中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為待測(cè)成分峰面積，Ci為待測(cè)成分濃度。精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 μL進(jìn)樣，以延胡索乙素為內(nèi)參物，采用多點(diǎn)校正法計(jì)算其余4種待測(cè)成分的fs/i。fs/a、fs/b、fs/c、fs/d分別為待測(cè)成分黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿。4種 成 分的fs/i分別為0.3705、0.7560、0.2214和0.3332，RSD均小于3.00%。見(jiàn)表3。

表3 以延胡索乙素為內(nèi)參物的fs/i計(jì)算結(jié)果（n=6）

2.12 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響分別采用Agilent 1260和SHIMADZU 2010A-HT高效液相色譜儀；Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱和Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，考察不同儀器與色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，測(cè)得各待測(cè)成分的fs/i，RSD均小于5.00%，表明建立的相對(duì)校正因子在不同儀器、色譜柱上有良好的適用性。見(jiàn)表4。

表4 不同儀器、色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.13 待測(cè)成分色譜峰定位對(duì)待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是實(shí)現(xiàn)多成分一測(cè)多評(píng)的前提，通常采用相對(duì)保留時(shí)間或保留時(shí)間差值的方法定位，而相對(duì)保留時(shí)間定位波動(dòng)較小、較穩(wěn)定［8-10］。故而選擇以延胡索乙素的保留時(shí)間相對(duì)值作為待測(cè)成分定位標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不同高效液相色譜儀和不同色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間（Ts/i），計(jì)算公式為T(mén)s/i=Rti/Rts，式中Rti、Rts分別代表待測(cè)成分和延胡索乙素保留時(shí)間。結(jié)果在不同高效液相色譜儀和色譜柱條件下，測(cè)得各待測(cè)成分相對(duì)保留時(shí)間Ts/i的RSD均小于5.00%。見(jiàn)表5。

表5 不同儀器、色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

2.14 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法比較取3批金鈴子散樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)成分峰面積。采用外標(biāo)法（the external standard method，ESM）計(jì)算各待測(cè)成分在金鈴子散中的含量，借助“2.11”項(xiàng)下建立的相對(duì)校正因子計(jì)算各待測(cè)成分含量，待測(cè)成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式［9］為：

公式（2）中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為待測(cè)成分峰面積，Ci為待測(cè)成分濃度，fs/i為待測(cè)成分與內(nèi)參物相對(duì)校正因子。

將QAMS和ESM的定量測(cè)定結(jié)果看作兩個(gè)多維空間向量，計(jì)算兩者的夾角余弦值得到余弦相似度反映兩種方法測(cè)定結(jié)果的相似性［11-12］，即余弦值越接近1，表明兩者相似度越高。夾角余弦值的計(jì)算公式為：

公式（3）中cosθ為夾角余弦值，X為QAMS的測(cè)量結(jié)果，Y為ESM測(cè)量結(jié)果，i為金鈴子散待測(cè)樣品編號(hào)。通過(guò)計(jì)算各待測(cè)成分夾角余弦值均為1.0000，表明QAMS和ESM定量測(cè)定結(jié)果高度相似，且這兩種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差均小于3.00%，見(jiàn)表6。

表6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法對(duì)5種生物堿成份的測(cè)定結(jié)果

由表6可知，3批金鈴子散中延胡索乙素含量在0.8839～1.0811 mg/g之間，黃連堿含量在0.2258～0.3605 mg/g之間，紫堇堿含量在0.3567～0.4051 mg/g之間，巴馬汀含量在0.1064～0.1908 mg/g之間，去氫紫堇堿含量在0.6422～0.8342 mg/g之間；擬定各成分含量最低值的80%為含量限度，待今后積累更多數(shù)據(jù)再做修訂。因此，暫定金鈴子散中延胡索乙素含量不得少于0.7071 mg/g，黃連堿含量不得少于0.1806 mg/g，紫堇堿含量不得少于0.2854 mg/g，巴馬汀含量不得少于0.0851 mg/g，去氫紫堇堿含量不得少于0.5138 mg/g。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)性成分的選擇生物堿為金鈴子散中代表成分，其中延胡索乙素有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、抗心肌缺血、抗胃腸道潰瘍、保肝等作用［13］，去氫紫堇堿有鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管等作用［14］，巴馬汀有降血糖、抗心律失常、提高免疫功能及抗老年癡呆等藥理活性［15］，黃連堿有胃黏膜保護(hù)、心肌保護(hù)、抑制A型單胺氧化酶、選擇性抑制和雙重抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等活性［15］，紫堇堿有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用［16］。因而選擇生物堿有效成分延胡索乙素、去氫紫堇堿、巴馬汀、黃連堿和紫堇堿為金鈴子散質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

3.2 內(nèi)參物選擇延胡索乙素性質(zhì)穩(wěn)定，廉價(jià)易得，不與其他成分反應(yīng)，分離效果較好，不受其他成分干擾，因此本研究選擇延胡索乙素為內(nèi)參物，所得相對(duì)校正因子穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好。

基于此，本研究建立了金鈴子散中延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀和去氫紫堇堿5種生物堿類(lèi)成分的一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法。采用不同儀器和色譜柱考察了所建立的相對(duì)校正因子耐用性，通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間法實(shí)現(xiàn)各待測(cè)成分色譜峰的定位，通過(guò)計(jì)算QAMS和ESM含量測(cè)定結(jié)果的余弦相似度評(píng)價(jià)QAMS用于金鈴子散質(zhì)量控制的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。本研究結(jié)果表明所建立的QAMS法準(zhǔn)確、精密，可用于金鈴子散中5種生物堿成分含量的測(cè)定，可提高金鈴子散質(zhì)量控制水平，推進(jìn)金鈴子散在臨床的科學(xué)化、規(guī)范化應(yīng)用。