基于網絡藥理學的仙茅-淫羊藿藥對治療卵巢早衰機制研究*

張歡歡，曾麗盈，李莉

1廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲之前出現閉經，伴促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高，雌激素（estradiol，E2）水平降低，并伴有一定圍絕經期癥狀。散發性POF在小于40歲女性中發生率為1%，小于30歲女性為0.1%，小于20歲女性為0.01%［1-3］。其病因及發病機制尚未明確。西醫治療大多選用激素替代療法，遠期療效不佳且有相關風險。中醫無“卵巢早衰”病名，按照其發病特點及臨床表現，可歸于“血枯”“閉經”“婦人臟躁”等范疇。

中醫認為腎藏精、主生殖，腎中精氣的盛衰與“腎-天癸-沖任-胞宮軸”的功能狀態密切相關，腎精氣虧虛、天癸早竭是本病的主要病機。治療應以補腎填精為法，多項臨床研究表明二仙湯及仙茅-淫羊藿藥對能有效治療POF，曾活等［4］研究認為二仙湯治療POF較常規西藥治療更具優勢，能夠改善患者臨床癥狀，調節其內分泌激素，而仙茅、淫羊藿兩者為此方君藥。仙茅為石蒜科多年生草本植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn的干燥根莖，具有補腎助陽、補益精血、強壯筋骨、行血消腫功效，主要用于腎陽不足、虛勞內傷和陽虛冷瀉等病癥［5］。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿E.brevicornumMaxim.的全草，味辛、甘，具有補腎陽、祛風濕、強筋骨功效［6］。由于中藥及其復方并非由單一藥物、單一成分組成，其具有“多成分、多途徑、多靶點”的協同作用特點，療效往往取決于其中有效成分的綜合作用。但目前藥理研究大多分析了單藥成分作用機制，而本研究利用網絡藥理學方法有助于進一步探討仙茅-淫羊藿藥對治療POF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 POF疾病靶點的獲取以關鍵詞“Premature ovarian failure”在人類基因組注釋數據庫Gene Cards（https：//www.genecards.org）和Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）兩個疾病靶點篩選數據庫檢索獲取與POF相關靶標基因，合并所獲得的數據，去除重復數據。

1.2 仙茅與淫羊藿化學成分和成分靶點信息獲取使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）及數據庫（version 2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平臺，設定藥物成分口服生物利用度（oral bioavailability，OB≥30%）和 類 藥 性（drug-likeness，DL≥0.18）分析篩選出仙茅、淫羊藿中具有良好OB和DL的化合物及其靶點。將TCMSP篩選出的成分靶點全稱輸入DrugBank和UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲取基因簡稱和Uniprot ID。

1.3 共同靶點獲取使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics（http：//bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）匹配映射藥物成分相關靶點，繪制維恩圖獲得仙茅-淫羊藿活性成分治療POF的潛在作用靶點。

1.4 藥物-活性成分-共同靶點-疾病網絡構建使用Cytoscape軟件（Version 3.6.2，http：//www.cytoscape.org）構建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”關系網絡。節點（node）代表疾病（POF）、仙茅（XM）-淫羊藿（XLP）藥種、藥物活性成分與疾病關鍵靶點基因；邊（edge）用來連接單味藥與活性成分、活性成分與疾病關鍵靶點基因、疾病與其對應的關鍵靶點基因。整個網絡展示藥物-活性成分-共同靶點-疾病之間的聯系。

1.5 關鍵靶點蛋白相關作用網絡構建通過STRING數據庫（https：//string-db.org/）獲得PPI蛋白互作圖，通過Cytospace軟件制作hub圖。

1.6 基因本體論富集分析（gene ontology,GO）與KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析使用DAVID數據庫功能注釋工具（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）對獲取的關鍵靶點進行GO與KEGG通路富集分析，選擇P＜0.05結果分析仙茅-淫羊藿藥對發揮藥理作用的主要生物過程及信號通路，并利用ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）平臺以氣泡圖的形式呈現。

2 結果

2.1 POF疾病靶點基于GeneCards，Drugbank數據庫收集POF相關靶點基因，刪除重復靶點后，共收集到POF疾病作用靶點3254個，得到的靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標準化。

2.2 仙茅-淫羊藿活性成分通過TCMSP數據庫以OB≥30%和DL≥0.18為條件檢索的仙茅潛在活性成分7個，淫羊藿潛在活性成分23個，見表1。

表1 仙茅-仙靈脾中潛在活性成分及其OB、DL值

2.3 仙茅-淫羊藿成分治療POF的潛在作用靶點通過TCMSP數據庫檢索仙茅-淫羊藿符合條件的潛在活性成分及其靶點，去重后，得到仙茅活性成分作用靶點61個，淫羊藿活性成分靶點217個。使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺將藥物潛在作用靶點基因同疾病基因進行匹配并繪制維恩圖，獲得共同基因41個，見表2。

2.4 藥物-活性成分-共同靶點-疾病網絡構建將仙茅、淫羊藿兩味藥物與POF的共同靶點及其對應的化合物導入Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-共同靶點-疾病網絡。網絡共包含74個節點，667條邊。仙茅-淫羊藿30個活性成分直接與關鍵靶點基因相連的有26個。見圖1—2。

圖1 POF疾病靶點基因與仙茅-淫羊藿靶點基因匹配情況

2.5 關鍵靶點基因的蛋白質互作網絡通過STRING數據庫繪制PPI網絡圖，選取其中度值（Degree）較高的前10位基因，利用Cytoscape

3.2.1 繪制hub蛋白網絡圖。見圖3—4。

圖2 藥物（仙茅-淫羊藿）-活性成分-關鍵作用靶點-疾病（POF）網絡

圖3 PPI蛋白互作網絡

圖4 Hub關鍵蛋白靶點圖

2.6 GO與KEGG通路富集分析GO功能富集結果顯示，仙茅-淫羊藿活性成分作用于POF的41個關鍵靶點基因涉及139個GO Terms，富集的生物學過程主要為藥物反應（response to drug），RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter），DNA模板（positive regulation of transcription，DNA-templated），信號轉導（signal transduction），對E2的反應（response to estradiol），對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide），RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始（transcription initiation from RNA polymeraseⅡpromoter），細胞增殖的正調控（positive regulation of cell proliferation），凋亡過程（apoptotic process），腺苷酸環化酶活性的激活（activation of adenylate cyclase activity），對有毒物質的反應（response to toxic substance），肽基絲氨酸磷酸化（peptidyl-serine phosphorylation），老化（aging），ERK1和ERK2級聯的正調節（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade），血管生成（angiogenesis），化學性突觸傳遞（chemical synaptic transmission），細胞信號轉導（cell-cell signaling），細胞增殖的負調控（negative regulation of cell proliferation），提示仙茅-淫羊藿可能通過調節上述主要生物學過程而發揮治療POF的作用。見圖5。

圖5 仙茅-淫羊藿活性成分治療POF共同靶點的GO生物學過程富集分析

KEGG通路富集分析顯示，仙茅-淫羊藿的活性成分作用于POF的41個關鍵靶點基因有60個GO Terms，其主要富集相關通路為癌癥途徑、cAMP信號通路、病毒致癌、血清素能突觸、鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路、多巴胺能突觸、癌癥中的蛋白多糖、神經活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、p53信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、腫瘤壞死因子信號途徑、MAPK信號通路等，提示仙茅-淫羊藿的活性成分靶點可能通過上述通路作用于POF，可作為未來研究仙茅-淫羊藿藥對治療POF療效的重要方向。見圖6。

圖6 仙茅-淫羊藿活性成分治療POF共同靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

二仙湯是由張伯訥教授創制的經驗名方，以仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、黃柏、知母為藥物組成，全方陰陽并用，以溫腎陽藥物仙茅、淫羊藿為主，故名“二仙湯”，臨床廣泛用于治療卵巢早衰、圍絕經期綜合征、不孕癥等。現代藥理學研究表明仙茅具有改善生殖軸功能以促生殖的作用，淫羊藿具有雌性激素樣作用［7-8］。

本研究結果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇3個活性成分作用于疾病關鍵靶點基因最多。其中Degeree前3的關鍵靶點基因為前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、核受體共激活劑2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）及前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1），表明以上成分及基因是仙茅-淫羊藿治療POF的重要成分及重要靶點基因，在仙茅-淫羊藿藥對治療POF中有重要意義。β-谷甾醇、豆甾醇屬植物甾醇，是合成固醇類激素的前體，具有類雌激素作用，對雌激素受體具有親和力［9］。β-谷甾醇具有抗炎、調節人體甾體激素等作用，亦能夠刺激卵巢顆粒細胞分化［10-11］。槲皮素屬植源性黃酮類化合物，結構類似于固醇類雌激素，在體內主要與雌激素受體結合，發揮弱雌激素樣作用［12］。因此，可認為β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是該藥對治療POF的主要活性成分。前列腺素內過氧化物合酶（PTGS）是合成前列腺素（PGs）的重要限速酶，目前發現該酶包含結構型PTGS1和誘導型PTGS2兩類，但在組織分布和表達調控方面有明顯差異，PTGS1屬組成性表達，而PTGS2是誘導性酶，通常在炎性反應、激素和腫瘤啟動子中被高度誘導［13］。卵巢顆粒細胞受LH刺激后可誘導PTGS2表達［14］。而前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是介導LH峰的關鍵，在卵泡發育中可直接刺激卵丘細胞擴展、卵母細胞成熟和卵子排出，其主要由顆粒細胞合成，分泌胞外后結合至卵丘細胞上的PGE2受體2和PGE2受體4（PTGER2、PTGER4），這兩種受體均通過活化胞內偶聯的Gas蛋白，進而激活腺苷酸環化酶，增加胞內環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量并促進透明質酸合酶2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)介導蛋白6的合成，引起卵丘細胞擴展，因此由PTGS/PGESPGE2-PTGER構成的PGE2網絡涉及卵泡發育的各個階段，尤其對細胞內cAMP濃度的調節及類固醇的合成，并激活PKC/PKA等信號通路的傳導發揮了重要作用［15］。故仙茅-淫羊藿藥對可能通過調節PTGS2、PTGS1靶點，促進PGE2合成，進而促使卵泡發育和成熟。NCOA2屬類固醇受體輔激活因子家族，可與受體相互作用從而以一種配體依賴模式增強轉錄活性［16］。

蛋白質相互作用網絡分析發現度值較高，且與其他靶點相互作用較密切的有轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3，CASP3）、PTGS2、孕酮受體（progesterone receptor，PGR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARG）、雄 激 素 受體（androgen receptor，AR）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin dependent kinase 2，CDK2）等（顏色越深，度值越高），可視為中藥活性化合物發揮作用的核心基因。研究發現當細胞受到損傷時可激活CASP3從而誘導細胞凋亡［17］。PGR可介導孕酮的生理作用，屬于甾體激素核受體家族成員，作為配體活化的轉錄因子在生殖活動中以及對介導與調節卵巢、子宮、乳腺功能發揮重要作用［18-20］。AR可參與卵泡生長的調節［21］，POF患者中AR基因（CAG）n重復序列延長，引起AR功能減弱、雄激素活性降低，進而導致雄激素對卵泡生長的調節功能異常，從而造成卵巢功能減退，成為卵巢早衰的可能致病因素［22］。本研究通過蛋白質相互作用網絡驗證了仙茅-淫羊藿藥對中的化合物是通過多靶點、整合調節的方式發揮作用。

GO富集分析和KEGG通路富集發現仙茅-淫羊藿藥對中活性成分可通過參與多種生物過程調節卵巢細胞信號轉導，促進細胞增殖、血管生成，抑制細胞凋亡等，這些靶點主要調節甲狀腺激素、細胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介導的卵母細胞成熟、TNF、P53、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）等信號通路發揮治療作用。其中甲狀腺素可恢復卵巢顆粒層-卵泡膜細胞上的FSH和LH受體并對內源性促性腺素有促進作用，從而促進卵巢中殘存的始基卵泡發育［23-24］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）存在于卵母細胞中，參與調節卵母細胞生長、原始卵泡發育以及顆粒細胞增殖、分化，是細胞增殖和凋亡最主要的信號傳導通路之一［25］，PI3K-Akt的過度激活可促使原始卵泡過早發育及卵泡過快凋亡，進而發展成為POF［26］。FSH可結合至卵巢顆粒細胞膜上的特異性受體并激活上游的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路繼而激活下游的PI3K/Akt通路和MAPK通路，誘導芳香化酶基因轉錄，調控雌激素和孕激素分泌，促使卵巢顆粒細胞成熟［27］，這對POF早發現、早治療甚至恢復卵巢功能有重要意義。TNF-α在體內的含量上升會導致早期卵泡出現凋亡，加快顆粒細胞（卵巢）凋亡［28-29］。LIANG等［30］研究發現p53信號通路可促進卵巢顆粒細胞凋亡。MAPK通路能夠調控基因表達及細胞的增殖、分化和凋亡［31］。因此，以上通路很可能是仙茅-淫羊藿藥對治療POF的潛在信號通路。

綜上所述，本研究發現仙茅-淫羊藿藥對中的β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等成分可能通過PTGS2、PTGS1、NCOA2等靶點作用于甲狀腺激素、細胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介導的卵母細胞成熟、腫瘤壞死因子信號途徑、P53、MAPK等多條信號通路發揮作用。因此，仙茅-淫羊藿藥對治療POF的藥理學機制可能是通過多組分、多靶點、多通路實現。但由于數據庫信息納入可能不全，中藥煎煮過程中成分的改變及相互作用，人體內藥代動力學的影響等，納入分析的成分不一定能真實反映人體內發揮治療作用的成分，故本研究存在一定局限性，其復雜的作用機制有待進一步實驗驗證。