扶正解毒化瘀方含藥血清聯合抗菌藥物對PA和MDRPA的體外抑菌作用*

王玉婷，王成祥，趙世同

1北京市和平里醫院,北京 100013；2北京中醫藥大學第三附屬醫院；3首都醫科大學附屬北京朝陽醫院

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是醫院常見的病原微生物，具有廣泛的致病性，是醫院獲得性感染中最常見的病原菌之一［1］。PA廣泛分布于自然界中［2］，具有可以獲得耐抗菌藥物基因的能力，因此能夠在醫院環境中存活，并且易于在患者之間傳播［3］。隨著臨床和農業抗菌藥物的泛用和濫用，在自身固有和適應性耐藥機制的作用下，部分PA對臨床多數常用抗菌藥物產生了耐藥性［4-5］。多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）的產生使臨床選擇抗菌藥物陷入困境，細菌感染相關性疾病的臨床經驗抗菌藥物療效不顯著［6-7］。因此，充分發揮中醫藥優勢，探索出一種抑制細菌生長的中醫藥治療方案，可為治療耐藥菌感染提供新突破口。

扶正解毒化瘀方是基于耐藥菌肺炎“正氣虧虛、痰瘀互結”的基本病機擬定，前期研究證實其可改善患者臨床癥狀［8］。本研究運用血清藥理學及微量稀釋法研究扶正解毒化瘀方含藥血清聯合抗菌藥物對PA和MDRPA的體外抑菌作用，以期為該方治療細菌性肺炎的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株實驗菌株由北京中醫藥大學東直門醫院檢驗科細菌室提供。分別從臨床診斷為PA和MDRPA所致肺部感染患者的深部呼吸道分泌物標本中分離、培養、純化、鑒定所得，傳代后置于-80℃冰箱保存備用。質控菌株：ATCC27853。

1.2 藥物扶正解毒化瘀方（北京康仁堂藥業有限公司配方顆粒）藥物組成：黃芩15 g，連翹15 g，漏蘆15 g，赤芍15 g，瓜蔞30 g，西洋參6 g，敗醬草30 g，薏苡仁30 g等，以上藥物劑量為成人1日用藥劑量；注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉[特治星，Wyeth Lederle S.R.L.，國藥準字J20080077，規格：4.5 g(哌拉西林4.0 g與他唑巴坦0.5 g)]。

1.3 動物SPF級SD大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量170～200 g，60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應性喂養1周。動物實驗在屏障環境實驗室進行。

1.4 試劑與設備MH瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基（賽默飛世爾生物化學制品有限公司）；營養肉湯（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，OXOID CM1168，1377374）；BDPhoenix-100 System型全自動細菌分析儀（美國BD公司，BD Phoenix）；LHS-250 HC-11型恒溫恒濕培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DDHZ-300型恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設備有限公司）；321A型臺式低溫離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；Multiskan MK3型酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清制備SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，隨機分為中藥大、中、小劑量組和空白對照組，每組10只。中藥大、中、小劑量分別對應人臨床等效劑量的8倍、4倍、2倍，連續給藥5天，每天2次，末次給藥后1 h將各組大鼠麻醉后予腹主動脈采血，離心后獲得含藥血清，56℃水浴滅活后分裝，-80℃保存備用。

1.5.2 菌懸液制備采用麥氏比濁法，將活化的PA和MDRPA配制成1×107CFU/mL濃度的菌液，現用現配。

1.5.3 中藥含藥血清及其聯合特治星的最小抑菌濃度（MIC）測定參考美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）發布的抗菌藥物藥敏試驗用微量肉湯稀釋法（M100-S24，USA，2014）［9］，分別測定不同濃度含藥血清對PA和MDRPA的MIC，并與特治星聯合使用測定MIC，同時與特治星的MIC進行比較。

1.5.3.1 扶正解毒化瘀方含藥血清和空白血清體外抑菌實驗分組：空白血清組及小、中、大劑量含藥血清組。取96孔板，用梯度稀釋法在每行1～8孔中分別加入含藥血清80、70、60、50、40、30、20、10 μL，再用營養肉湯補齊至200 μL；在9、10孔中直接加入200 μL肉湯；將活化后的濃度為1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌懸液10 μL加入1～9孔中，最終接種菌量約為5×105CFU/mL；9孔為陽性對照，10孔不加菌液，為陰性對照；上述操作重復3次，37℃恒溫恒濕靜置培養18～24 h，酶標儀（single，570 nm）檢測相應光密度（optical density，OD）值。

1.5.3.2 特治星及其聯合含藥血清對PA和MDRPA的體外抑菌實驗配制4096 μg/mL（按照哌拉西林量計算）的特治星溶液備用；對特治星原液進行對倍稀釋，第1孔初始濃度為2048 μg/mL，稀釋成11個濃度梯度；將上述稀釋后的特治星溶液分別加入到相應96孔板的1～11孔中，每孔100 μL；1～11孔中再分別加入60 μL的肉湯及40 μL血清，12孔加200 μL肉湯；將活化后的濃度為1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌懸液10 μL加入1～9孔中，最終接種菌量約為5×105CFU/mL，12孔不加菌液，為陰性對照。上述操作重復3次，37℃恒溫恒濕靜置培養18～24 h，酶標儀（single，570 nm）檢測相應OD值。

1.5.4 特治星及其聯合含藥血清的抑菌作用測定（K-B紙片法）分組：特治星組、特治星+空白血清組、特治星+2倍血清組、特治星+4倍血清組、特治星+8倍血清組、特治星+中藥組臨床等效中藥水提物。將活化的菌株使用比濁儀配制成0.5麥氏單位的菌懸液；用無菌棉簽浸入配制好的菌液，用拭子劃線整個MH瓊脂培養基，從平板頂部到底部，均勻涂布，每次旋轉平板約60°，涂抹3次，確保每次接種菌液均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈，防止菌懸液流動，并使菌液涂布于整塊平板的每個角落。按照預先設定的分組，將抗菌藥物紙片貼于已接種細菌的瓊脂表面。37℃恒溫恒濕孵育18～24 h，使用游標卡尺測量抑菌環的直徑。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0分析數據，方差齊采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；方差不齊采用Welch近似方差分析，多重比較采用Dunnett’S T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中藥含藥血清及其聯合特治星的MIC測定（微量稀釋法）中藥顆粒劑含藥血清無明顯抑菌作用。與空白血清聯合特治星比較，中藥含藥血清聯合特治星不能顯著降低PA的MIC；中藥2倍、4倍含藥血清聯合特治星不能降低MDRPA的MIC；中藥8倍含藥血清聯合特治星能降低一個梯度的MDRPA的MIC。ATCC27853特治星的MIC是2 μg/mL。見表1。

表1 各組對PA及MDRPA的體外MIC μg/mL

2.2 特治星及其聯合含藥血清的抑菌作用測定（K-B紙片法）從恒溫恒濕培養箱中取出過夜孵育的固體培養基，觀察細菌生長情況，采用游標卡尺測量各組抑菌環的直徑。見表2。

表2 各組抑菌環直徑（K-B紙片法） mm

3 討論

體外抑菌試驗作為基礎研究方法，是抗菌藥物研究過程中重要的試驗手段和關鍵環節，被廣泛應用于藥物的篩選、臨床藥敏試驗、抗菌譜效價測定及活性物質的追蹤等研究領域，是評價藥物抗菌效能較經典也是最直接的研究方法［10］。目前在中藥體外抑菌作用研究中稀釋法和紙片法是最常應用的研究方法。

在中醫藥的研究中，無論中藥單藥還是中藥復方，在抑菌、殺菌方面都積累了豐富的經驗，而且在臨床細菌感染相關疾病的治療中發揮重要作用。有研究表明蒲公英、黃連、夏枯草、五倍子、烏梅、絲瓜絡等中草藥對PA有一定抑菌作用［11-12］，中草藥衍生物黃芪多糖有抗呼吸道PA感染的功效［13］。在聯合用藥方面金銀花能增強慶大霉素的體外抑制PA效果［14］，中藥復方芪歸銀方提取物可降低多種抗菌藥物的MIC［15］。由于中草藥所含成分復雜多樣，無論對單藥還是復方體外抑菌作用的研究干擾因素較多，藥效物質基礎不明確，藥理作用機制和代謝過程等問題難以做出清楚解釋，因此很難對中藥體外藥效學作出客觀評價［16］。上世紀80年代初，日本著名藥理學家田代真一首次提出“血清藥理學”。他認為中草藥制劑口服進入體內后經過胃腸道的消化以及內環境菌群的代謝和排泄等過程而發揮治療作用，因此中草藥制劑作用于人體的藥效物質基礎是機體生物轉化的產物，這些產物被吸收入血后與血漿蛋白相結合，通過血液循環作用于不同組織或器官［17］。國內學者王喜軍在上世紀90年代便提出了“中藥血清藥理學”，為中醫藥藥效學研究開創了新思路，相比于直接用傳統中草藥制劑干預的體外試驗，含藥血清的生物活性更加合理，其結果更具可信度。將中草藥藥劑通過灌胃方式給藥，經過動物的消化、吸收、代謝等過程，使得其含藥血清能更直接地反映中草藥制劑的藥理作用，并能夠更科學地對中草藥制劑的療效和機制進行闡述。但針對體外抑菌試驗，含藥血清作為干預因素也存在較多缺陷。含藥血清成分復雜，不僅存在一定的滲透壓，其中還包含許多有助于細菌生長的營養物質，對試驗結果有一定干擾。本研究參考2014年CLSI發布的抗菌藥物藥敏試驗，建立了方便、快捷、易操作的微量肉湯稀釋法。本研究發現，單一的中藥含藥血清未體現出明顯體外抑菌作用。對于PA，與空白血清聯合特治星比較，中藥含藥血清聯合特治星不能顯著降低MIC值。對于MDRPA，與空白血清聯合特治星比較，中藥2倍、4倍含藥血清聯合特治星不能降低MIC值，而中藥8倍含藥血清聯合特治星能降低一個梯度的MIC值。提示含藥血清能夠一定程度敏化MDRPA，降低特治星對MDRPA的最小抑菌濃度，但有效的藥物濃度較高，遠遠超出了臨床等效劑量，對臨床治療有一定的指導意義，但與臨床用藥規范不符。

紙片法是通過藥物在瓊脂上擴散抑制其周圍細菌的生長而形成抑菌環圈，根據對應抑菌圈直徑的大小判定細菌對某藥物的敏感性，可分為敏感、中介、耐藥。本研究結果顯示扶正解毒化瘀方不同濃度含藥血清或中藥水提物與特治星對PA及MDRPA并無明顯聯合抑菌作用。此結果與微量肉湯稀釋法的結果存在一定差異?？紤]紙片擴散法試驗中抑菌圈的直徑大小受諸多因素影響，如培養基質量、細菌接種量、藥敏紙片質量、紙片含藥的準確性和均勻性等，且含藥血清本身成分復雜，是細菌生長的較好營養物質。因此，尚需進一步優化抗菌藥物聯合含藥血清的K-B紙片法試驗細節，進一步探索扶正解毒化瘀方及其含藥血清在K-B法中的體外抑菌作用。

綜上所述，本研究得出高濃度扶正解毒化瘀方含藥血清有一定體外抑菌作用，可一定程度恢復MDRPA對TZP的敏感性，可能存在延緩甚至逆轉PA耐藥性的作用，為扶正解毒化瘀方可能干預PA耐藥機制體現療效的假設提供了研究基礎，并對臨床耐藥菌感染性疾病的治療提供了新思路。