復方雷公藤湯最佳劑量配比的正交試驗設計及其對雌性腎病大鼠生殖系統減毒增效的作用*

李波，金伶佳，吳美蘭

1大連市皮膚病醫院，遼寧 大連 116021；2大連市中心醫院；3大連市中醫醫院

雷公藤是一種作用廣泛、療效獨特而毒性較大的藥物，治療類風濕關節炎有獨特療效［1］，對各種腎病、慢性腎炎有較好的降低尿蛋白、保護腎功能作用，但又對多系統、多臟器有損害，對生殖系統的損害尤為突出，可引起女性患者月經紊亂，甚至繼發卵巢早衰［2］。許多難治性疾病采用雷公藤治療，療效顯著，但有較大副作用［3］。本研究采用正交試驗設計方法，對雷公藤湯復方進行最佳劑量配比研究，以期更好地指導臨床用藥［4］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通級7～8周齡Wister雌性大鼠90只，體質量（200±10）g，均未曾交配，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，動物實驗合格證號：SCXK（遼）2018-0209。

1.2 藥物與試劑中藥雷公藤（福建）為衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.全株，制何首烏（四川）為蓼科多年生纏繞草本植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的塊根，當歸（甘肅）為傘形科多年生草本植物當歸Angelica sinensis Diels的根，甘草（內蒙）為豆科多年生草本植物Glycyrrhiza glabraL.的根及莖，均購于大連同仁堂藥房。注射用鹽酸阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司，批號：180916，規格：10 mg/支）。電化學發光試劑盒（南京建成生物公司，批號：20180827）。

1.3 主要儀器ES-J系列電子分析天平（沈陽龍騰電子稱量儀器公司）；3-16K型冷凍離心機（Sigma）。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組參照BERTANI T等［5］方法，模型組大鼠在非麻醉下按6.5 mg/kg（體質量）一次性尾靜脈注射阿霉素復制腎病模型。造模3天后大鼠逐漸出現食欲減退、行動遲緩、皮毛無光澤、廝咬、煩躁、腹水情況，造模第7天后用代謝籠收集大鼠24 h尿液，尿蛋白定量呈漸進性增多，提示造模成功。造模成功后按完全隨機化原則將大鼠分為9組各10只，分籠飼養。

1.4.2 正交試驗設計復方雷公藤湯中雷公藤為君藥，臣為制何首烏、當歸，使為甘草。4味中藥按體表面積換算法，D鼠＝D人×R鼠/R人，確定各味藥的劑量，高、中、低劑量雷公藤分別為120、90、60 g，何首烏分別為72、54、36 g，當歸分別為72、54、36 g，甘草分別為60、36、12 g。每味藥為1個因素，共有4個因素，每個因素采用高、中、低3個劑量即3個水平，即L9（34）正交表［6］。見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.4.3 動物給藥復方雷公藤湯不同劑量組方各加水2000 mL，雷公藤先煎1 h后下諸藥，常規煎煮2次，去藥渣后合并藥液，濃縮成300 mL。各組大鼠從造模第15天起經口灌藥2 mL，每日1次，連續給藥14天。

1.5 觀察指標

1.5.1 性激素打開腹腔，剝離臟器，暴露腹主動脈，用10 mL注射器抽取6 mL動脈血，離心半徑10 cm，3000 r/min離心10 min，分離血清后按電化學發光試劑盒說明書測定促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）含量。

1.5.2 24 h尿蛋白定量治療14天后用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，測24 h尿蛋白定量。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0軟件分析數據，使用正交試驗設計助手3.1，按正交表L9（34）四因素三水平安排試驗，通過直觀、極差及方差分析篩選最佳劑量配比。

2 結果

2.1 性激素復方雷公藤湯不同劑量配比對腎病大鼠血清雌二醇影響由大到小依次為雷公藤＞當歸＞甘草＞制何首烏，卵泡刺激素由大到小依次為雷公藤＞當歸＞甘草＞制何首烏，黃體生成素由大到小依次為雷公藤＞當歸＞甘草＞制何首烏。方差分析顯示［7］，雷公藤（A）、制何首烏（B）、當歸（C）、甘草（D）各組比較差異均具有統計學意義，綜合直觀分析和方差分析結果，確定A3B2C1D3為最佳配比劑量。其中雷公藤對雌性腎病大鼠生殖系統E2、FSH、LH影響較大。見附表1及表2—4。

表2 E2方差分析

表3 FSH方差分析

表4 LH方差分析

2.2 24 h尿蛋白定量復方雷公藤湯不同劑量配比對腎病大鼠24 h尿蛋白影響由大到小依次為雷公藤＞甘草＞制何首烏＞當歸。方差分析顯示，雷公藤（A）、制何首烏（B）、甘草（D）比較差異均具有統計學意義，當歸（C）無統計學意義。綜合直觀分析和方差分析確定A1B3C3D3為最佳配比劑量。其中雷公藤與甘草影響較大，制何首烏影響較小，當歸無影響。見表5—6。

表5 24 h尿蛋白定量直觀分析（±s）

表5 24 h尿蛋白定量直觀分析（±s）

因素復方雷公藤湯1號復方雷公藤湯2號復方雷公藤湯3號復方雷公藤湯4號復方雷公藤湯5號復方雷公藤湯6號復方雷公藤湯7號復方雷公藤湯8號復方雷公藤湯9號尿蛋白mg/24 h K1 K2 K3 R雷公藤（A）1 1 1 2 2 2 3 3 3 147.1 238.2 261.3 114.2制何首烏（B）1 2 3 1 2 3 1 2 3 223.6 202.5 220.5 21.1當歸（C）1 2 3 2 3 1 3 1 2 214.4 220.3 211.9 8.4甘草（D）1 2 3 3 1 2 2 3 1 228.3 224.3 194.0 34.3 24 h尿蛋白定量（mg/24 h）55.60 49.20 42.30 76.50 78.10 83.60 91.50 75.20 94.60

表6 24 h尿蛋白定量方差分析

3 討論

近年來，中藥臨床用藥的安全性問題受到廣泛關注，同時也是中醫藥走向世界的主要壁壘［8］。歷代醫家采用配伍、炮制、調整用量等方法對有毒中藥實施減毒增效，而其中配伍減毒法又派生相殺、調和、佐制、扶正等減毒法，以及基于中醫基礎理論進行性味歸經的配伍減毒［9］。復方雷公藤湯據諸法組合而成，方含雷公藤、制何首烏、當歸、甘草，功用益氣養血，解毒化濁，利水消腫。以雷公藤活血解毒、消腫除濕為君。制何首烏、當歸補氣血扶正，益精血，以防雷公藤戕伐之害，為臣藥。甘草補中益氣扶正，解藥毒緩君藥之性，可調和諸藥，為使藥。甘草是最常用的中草藥之一，具清熱解毒、保肝抗炎和調和諸藥等功效。前期復方雷公藤湯及拆方對腎病大鼠心臟的減毒增效作用研究結果表明雷公藤配伍后可減低其對心臟毒性的作用［10］。

本研究結果表明，在降低雌性腎病大鼠生殖系統影響因素方面，復方中雷公藤影響最大，其生殖系統毒性隨雷公藤劑量增加而增高，當歸對減低腎病大鼠生殖系統毒性有較大影響，何首烏和甘草對減低腎病大鼠生殖系統毒性有作用，但影響較小，因此確定A3B2C1D3為最佳劑量配比，提示臨床女性患者服用雷公藤治療疾病時，可采用這種劑量配比來減低生殖系統毒性。減少腎病大鼠24 h尿蛋白方面，復方雷公藤湯中雷公藤具有最大影響作用，其作用隨雷公藤劑量加大而增高；甘草也有較大影響，采用低劑量甘草效果優于高劑量，制何首烏對降低腎病大鼠24 h尿蛋白有作用，但影響較小，因此確定A1B3C3D3為最佳劑量配比，提示臨床治療腎病時可采用這種劑量配伍來減少腎病患者24 h尿蛋白。

雷公藤對女性患者的副作用臨床主要表現為月經紊亂、閉經、卵巢早衰和性功能減退等，青春期及育齡女性患者在服用雷公藤治療疾病時要綜合考慮用藥劑量及周期，安全合理用藥，需控制其含有量、用藥劑量、時間，從而降低風險，達到安全有效的用藥目的［11］。

目前中藥減毒實踐中應用最為有效和廣泛的方法是炮制及配伍減毒法，結合細胞模型和體內代謝組學研究，對臨床合理用藥具有重大意義［12］。要在中醫藥辨證論治和整體觀念的指導下，先通過化學分析方法檢測雷公藤配伍前后有效成分與毒性成分的含量變化，再結合動物實驗的藥效與毒效研究，開展雷公藤配伍減毒機制研究，篩選出雷公藤的毒效關系最優化的中藥小復方，以提高腎病、皮膚病、類風濕關節炎等難治疾病的療效［13-14］。下一步，在人體、動物模型和細胞3個層次，蛋白、基因和轉錄調控多個水平開展雷公藤及其提取物治療各種疾病的機制研究，深入了解雷公藤治療疾病的機制［15］，為雷公藤相關制劑的開發和應用提供依據［16］。

附表1血清性激素直觀分析