基于Notch1/NF-κB信號通路探究補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的拮抗作用及其機(jī)制*

李偉藝，劉紅松，高山瑛，蘇志強(qiáng)

漢中市人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，陜西 漢中 723000

缺血性腦卒中是具有高致殘率和致死率的臨床常見疾病，是腦卒中相關(guān)死亡的主要原因［1］。雖然恢復(fù)腦組織血液供應(yīng)是治療急性缺血性腦卒中的主要目的，但這一過程同時(shí)加重了腦組織損傷，即腦缺血再灌注損傷［2］。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，目前臨床尚無有效治療方法［3］。補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性腦卒中氣虛血瘀證的經(jīng)典中藥方劑。研究表明，補(bǔ)陽還五湯單獨(dú)或聯(lián)合其他療法對缺血性腦血管病及其后遺癥均有療效，能抑制氣虛血瘀證患者內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元再生［4-7］。雖然已有研究表明補(bǔ)陽還五湯對腦缺血疾病具有再灌注保護(hù)和治療作用，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。Notch信號通路是一個(gè)進(jìn)化高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起重要作用。缺血性腦卒中發(fā)生后，Notch通路的相關(guān)因子表達(dá)水平改變，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，加重炎癥反應(yīng)，影響疾病的發(fā)展進(jìn)程［8-10］。本研究以Notch/NF-κB信號通路為切入點(diǎn)，分析補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級SD大鼠75只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時(shí)換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。

1.2 藥物、試劑與儀器補(bǔ)陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，川芎3 g，地龍3 g）由漢中市人民醫(yī)院藥劑科煎制濃縮成含生藥2 g/mL藥液；Jagged1（MCE公司，貨號：HY-P1846A）；TTC染色液、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Revert AidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific）；神經(jīng)源性位點(diǎn)缺口同源蛋白1抗體（Notch1）、NF-κB p65、磷酸化激活核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（phosphorylated nuclear factor-κB p65，p-NF-κB p65）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy division related enhancer,Hes1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單抗、羊抗兔二抗（美國CST公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；7500型PCR儀（美國Applied Biosystems）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；G：BOX型多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥75只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組、Jagged1組，每組15只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后造模。參考文獻(xiàn)［11］方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血90 min后去除線栓恢復(fù)血流供應(yīng)，即再灌注24 h。各給藥組大鼠于術(shù)后清醒2 h后開始給藥，補(bǔ)陽還五湯組大鼠灌胃補(bǔ)陽還五湯16 g/kg，早晚各1次，連續(xù)7天；補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組大鼠灌胃補(bǔ)陽還五湯藥液16 g/kg，早晚各1次，同時(shí)腹腔注射25 mg/kg Jagged1溶液，隔日1次，連續(xù)7天；Jagged1組大鼠腹腔注射25 mg/kg Jagged1溶液，隔日1次，連續(xù)7天；假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能評分采用Longa法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向外側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失；5分：死亡，評分為4～5分大鼠剔除實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 大鼠腦梗死體積檢測（TTC染色）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，-20℃冷凍20 min，沿冠狀面將大腦切成2 mm厚的連續(xù)5份切片，置于0.2% TTC染色液中，37℃避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照，Image J軟件計(jì)算大鼠腦梗死體積。

1.3.4 大鼠海馬神經(jīng)元損傷觀察（HE染色）大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，腦組織用4%多聚甲醛固定，冠狀切取含海馬的視交叉前后3 mm腦組織，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），脫蠟至水，行HE染色，觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況。

1.3.5 海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性檢測（ELISA法)大鼠麻醉后處死，分離海馬組織，檢測海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性。

1.3.6 B淋巴細(xì)胞瘤(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）mRNA水平檢測（RT-qPCR）取各組大鼠海馬組織，加入Trizol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl2 1.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物各1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.7 Notch1/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)檢測（Western blot法）取各組大鼠海馬組織，研磨勻漿后提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，定量完畢后于蛋白中加入loading buffer，在EP管中混勻，置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。隨后配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，一抗稀釋比例為1∶2000，4℃過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗（1∶1000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。Western blot實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH，應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白對應(yīng)灰度值，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能損傷情況與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷，神經(jīng)功能評分升高（P＜0.05），經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，大鼠神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）。與補(bǔ)陽還五湯組比較，補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組大鼠神經(jīng)功能評分升高（P＜0.05），且Jagged1組大鼠神經(jīng)功能評分高于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組。見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分

2.2 大鼠腦梗死體積變化情況與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積增加（P＜0.05）。與模型組比較，經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后大鼠腦梗死體積減少（P＜0.05）。與補(bǔ)陽還五湯組比較，補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組大鼠腦梗死體積增加，Jagged1組大鼠腦梗死情況更嚴(yán)重（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腦梗死體積比較

2.3 大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列緊密，細(xì)胞核清晰，染色均勻。模型組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞核變形、固縮、破碎，染色加深，細(xì)胞排列松散且有空腔形成。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后海馬神經(jīng)元損傷情況改善，Jagged1干預(yù)使補(bǔ)陽還五湯對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用減弱，且Jagged1組海馬神經(jīng)元損傷較補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組更嚴(yán)重。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況（HE×400）

2.4 大鼠海馬組織炎癥和氧化應(yīng)激情況與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量降低，GSH-Px、SOD活性增加（P＜0.05）。與補(bǔ)陽還五湯組比較，補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組IL-6、TNF-α、MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05），且Jagged1組IL-6、TNFα、MDA含量高于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組，GSH-Px、SOD活性低于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織炎癥因子和氧化應(yīng)激水平比較（±s）

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與補(bǔ)陽還五湯組比較，P＜0.05；d表示與補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組補(bǔ)陽還五湯組補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組Jagged1組鼠數(shù)15 12 13 12 11 IL-6（ng/L）250.15±39.41 790.56±52.82a 349.21±33.64ab 687.25±40.92abc 867.65±46.37abcd TNF-α（ng/L）230.41±32.68 1600.95±47.13a 890.65±45.38ab 1307.26±48.72abc 1901.85±60.14abcd MDA（nmol/mg）11.22±1.34 19.32±1.26a 14.81±1.22ab 16.88±1.29abc 22.94±1.38abcd GSH-Px（U/mg）96.26±9.88 42.32±7.21a 70.68±8.02ab 55.29±6.94abc 33.84±6.12abcd SOD（U/mg）230.59±17.42 102.46±15.33a 195.62±16.84ab 157.34±19.72abc 90.59±13.95abcd

2.5 大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織Bax與Caspase-3的mRNA表 達(dá) 增 加，Bcl-2 mRNA表 達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組Bax與Caspase-3的mRNA表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA增加（P＜0.05）。與補(bǔ)陽還五湯組比較，補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組 和Jagged1組Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），且Jagged1組Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)高于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組，Bcl-2 mRNA表達(dá)低于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)

2.6 Notch1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織Notch1、p-NF-κB p65及Hes-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在補(bǔ)陽還五湯基礎(chǔ)上加入Jagged1干預(yù)，Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達(dá)增加，Jagged1組上述蛋白表達(dá)量高于補(bǔ)陽還五湯+Jagged1組（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠Notch1/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)

3 討論

缺血性腦卒中是指由于腦供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞引起腦供血不足所致的腦組織壞死的總稱，其治療方法以溶栓為主，但在治療過程中可能繼發(fā)新的病理改變，誘發(fā)缺血再灌注損傷［12-13］。腦缺血再灌注損傷過程中的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起腦卒中患者腦組織損傷、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知神經(jīng)功能異常的主要原因，可間接反應(yīng)患者的腦損傷程度［14］。本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能損傷，腦梗死體積顯著增加，神經(jīng)元損傷明顯，海馬組織炎癥因子IL-6和TNF-α含量增加，氧化應(yīng)激因子MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低，表明模型組大鼠腦組織發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，腦損傷明顯，提示造模成功。

補(bǔ)陽還五湯是治療氣虛血瘀證腦中風(fēng)恢復(fù)期的經(jīng)典方劑，方中重用黃芪大補(bǔ)臟腑經(jīng)脈營衛(wèi)之氣，當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花、川芎共為臣藥行氣活血，地龍為佐藥通經(jīng)活絡(luò)、舒暢血脈，諸藥相互為用，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效［15］。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能損傷減輕，腦梗死體積縮小，海馬神經(jīng)元損傷減輕。大量研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)作為腦缺血再灌注后的關(guān)鍵分子機(jī)制，其對缺血性腦疾病的發(fā)生發(fā)展過程具有重要作用，針對這些機(jī)制進(jìn)行靶向治療顯示出較好的神經(jīng)保護(hù)作用［16-17］。周佳［18］、賈壯壯等［19］研究表明，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，有效減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯可降低腦缺血大鼠海馬組織中IL-6、TNF-α、MDA含量，提高GSH-Px、SOD活性。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，Bax過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2可與Bax形成二聚體抑制Bax基因表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡因子Caspase-3及其家族的其他因子，引起衰老和凋亡的發(fā)生［20］。在本研究中，經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后腦缺血大鼠海馬組織Bax與Caspase-3的mRNA表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA增加，表明補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用。

Notch信號通路在進(jìn)化上有高度保守性，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及干細(xì)胞自我更新活動(dòng)密切聯(lián)系，是調(diào)控神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵信號通路之一［21-22］。研究表明，腦缺血發(fā)生時(shí)γ-分泌酶被瞬時(shí)激活，使得海馬中Notch1水平上調(diào)，而Notch1可使NF-κB中的p65亞基增加，進(jìn)一步加重炎癥細(xì)胞浸潤，炎性因子的表達(dá)水平升高，加重腦缺血期的神經(jīng)元損傷［23］。Hes1是Notch1的下游靶基因，其表達(dá)水平直接反映了Notch1表達(dá)情況［24］。本研究顯示補(bǔ)陽還五湯降低了Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達(dá)水平，表明補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與Notch/NF-κB信號通路有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)陽還五湯是否通過Notch/NF-κB信號通路發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，本研究使用了Notch1抑制劑Jagged1，結(jié)果顯示Jagged1的干預(yù)削弱了補(bǔ)陽還五湯減輕大鼠神經(jīng)功能和海馬神經(jīng)元損傷、縮小腦梗死體積的作用，同時(shí)加重了氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白的表達(dá)水平增加，而這種現(xiàn)象在Jagged1組更為顯著，說明在Jagged1干預(yù)下，Notch1表達(dá)被上調(diào)，加重腦缺血再灌注損傷，而補(bǔ)陽還五湯可以拮抗這種作用，發(fā)揮對腦缺血后腦組織和神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了補(bǔ)陽還五湯可下調(diào)Notch1表達(dá)，抑制Notch1/NF-κB信號通路的激活，發(fā)揮對缺血再灌注腦組織的保護(hù)作用。但該調(diào)控過程中是否有其他相關(guān)蛋白的參與，仍需進(jìn)一步研究。