細胞游離DNA片段組學用于慢性肝病診斷的研究進展

曾偉蘭 李璟 汪艷

細胞游離DNA通常指外周循環血中所有未被包裹的無細胞DNA (cfDNA)，其來源被認為是主要自凋亡或壞死細胞釋出，還有一些自正常細胞生理性釋出，而進入循環血的DNA片段[1]。 典型cfDNA為長度小于200堿基對(bp)、平均長度約169 bp的DNA雙鏈片段。cfDNA不僅可以從外周血中檢測，一些研究還從尿液、糞便、腦脊液、唾液、胸水和腹水中分離和分析cfDNA。近期發現DNA核酸酶和DNA片段化因子等參與了胞內cfDNA形成，但其中詳細的生成和釋出機制還未全面揭示[2]。通常吞噬細胞會迅速清理這些釋出片段，使得健康人體生理狀態下血漿中cfDNA平均濃度約在10～15 ng/mL，這些cfDNA大部分來自造血細胞，微量來自肝臟[3]。 當某組織細胞來源cfDNA異常大量出現超出吞噬能力時，會以不同堿基片段長度及其不同濃度顯著出現在循環血中，并且這些指標的變化范圍比較大。cfDNA是液體活檢研究領域的重要組成部分，其臨床應用實踐目前主要在產前診斷和腫瘤學等領域。

由于無創性檢測本身在篩查、早診、隨訪、預后判斷等方面具有比較明確的應用優勢，cfDNA作為一種理論上可以反映組織學損傷及其原位機制信息的無創指標，已有大量研究工作對其生物學功能相關特征進行探索。其中，關于cfDNA片段分布特征的分析研究，如片段長度及其頻率譜，被稱為cfDNA片段組學。隨著序列分析能力尤其是測序技術和生物信息學分析技術的飛速進步和完善豐富， cfDNA片段組學的指標和解讀內容相應增加，如末端基序、首選末端、核小體印跡、鋸齒末端、DNA 拓撲學、遺傳和表觀遺傳學信息等，顯示出可以為相關領域疾病診斷甚至治療決策提供新標志物的應用潛力[4-5]。這些研究陸續發現cfDNA片段組學特征并非是隨機性的，組織細胞來源、疾病進展階段、年齡、DNA核酸酶活性，以及序列分析技術等都是影響cfDNA片段組學特征的重要因素[6- 7]。還有一些共性發現如，腫瘤細胞來源cfDNA較非腫瘤來源cfDNA的堿基數量小，胎兒來源cfDNA較母體來源cfDNA也存在此特點。

cfDNA應用研究在肝病領域已涉及多種肝病。目前報道最多的是關于在肝腫瘤診療預后等方面的判斷能力以及對肝轉移癌的診斷分析等，常見的判斷指標包括各類突變類型和分布、拷貝數、甲基化特征、首選末端基序、線粒體DNA突變等，以體現腫瘤組織DNA變異特點為其理想表現[8]。 但是，基于序列突變和修飾現象本身的變異性大、含量甚微，意味著準確測量的技術挑戰比較大，因此研究者又嘗試應用cfDNA片段組學信息，如鋸齒末端[6- 9]， 進行分析評估。最近一項前瞻性單中心研究采用全基因組測序技術，對來自192例原發性肝癌和170例無腫瘤對照組患者血漿的cfDNA片段長度及其數量進行測量，然后將這些數據轉化為片段長度比率和片段分布率兩類指標，以這兩類指標數據作為輸入變量、以該隊列診斷結果為輸出變量，用機器學習工具進行建模，再將此模型用于另一個分布情況類似的、含189例原發性肝癌和165例無腫瘤對照組的獨立隊列進行診斷能力測試，發現該模型在肝癌檢出方面的總體判斷表現很好(觀察者曲線下面積 0.995，敏感性 96.8%，特異性98.8%)，尤其對早期原發性肝癌(在該研究隊列總人數比率占70.3%～74.1%)、不大于3 cm的小腫瘤，肝細胞癌或膽管癌的敏感性很高(95.9%～100%)[10]。 總之，盡管采用各種cfDNA指標的肝腫瘤診斷方法紛紛呈現，不少甚至有突出結果，但至今就cfDNA輔助診斷對這類患者長期預后的影響仍未有確切報告。cfDNA在早期診斷肝移植相關肝損傷的應用研究也有不少研究探索。近期一些研究提出，供體來源 cfDNA 濃度持續增加可能有助于更加早期地判斷急性排斥反應發生，并用于分辨移植肝急性失功是否主要源于排斥反應[11-12]； 但同期也另有研究顯示，這些指標預測能力的可靠性也許比較有限[13]。

與肝腫瘤和肝移植方面的應用研究相比，cfDNA在慢性肝炎性肝病中的指標意義還存在較多未知。非酒精性脂肪性肝病/肝炎(NAFLD/NASH)已成為全球主要常見肝病。有研究回顧性分析了58例NAFLD患者和13例健康者的血樣，采用實時定量PCR測量發現NAFLD組的90 bp cfDNA水平顯著高于健康組，NAFLD組中的90 bp和222 bp兩種cfDNA濃度變化都與該組患者的疾病活動度和疾病程度顯著相關[14]。另一項研究對49例疾病進展情況包括了從NAFL到肝硬化的NAFLD患者進行了血漿cfDNA分析，指標包括總cfDNA、編碼cfDNA、Alu重復序列、線粒體DNA拷貝和5甲基2‘脫氧胞苷的濃度水平；發現肝硬化較非肝硬化患者的總cfDNA水平和編碼cfDNA水平顯著降低，而5甲基2‘脫氧胞苷水平顯著增高；且肝硬化與低水平總cfDNA和編碼cfDNA之間存在獨立相關性[15]。有研究對52例肝硬化急性失代償、57例入院診斷為慢加急性肝衰竭，以及40例健康對照進行觀察，發現血漿中總cfDNA水平在慢加急性肝衰竭患者高于肝硬化急性失代償患者，器官衰竭病情嚴重或入院后30 d內死亡的患者中的總cfDNA水平也較高[16]。 還有研究在對乙酰氨基酚過量引起急性肝損傷的小鼠模型和患者的血漿中，發現肝細胞來源cfDNA濃度會大幅增加，該指標會隨著治療情況變化，較常規生化指標變化似乎更敏感[17]。 近期一項基于cf核小體測序策略的探索性技術研究初步顯示，通過進一步獲取其中轉錄組信息，可以辨識不同病因學的慢性肝病包括NAFLD、NASH、自身免疫性肝炎、肝移植、心源性肝損傷、部分肝切除等，甚至可以分辨出肝損傷分布的主要組織區帶[18]。這類新技術也許可以進一步提高cfDNA在慢性肝炎性肝病中的應用潛力。

盡管近十年來不少概念驗證性研究提示，與臨床上傳統使用的有創指標和基于血液分析的無創診斷指標相比，cfDNA檢測在特定疾病診療中具有獨特優勢，但cfDNA在研究廣泛性和應用普及性方面仍未見顯著突破，對于大多數臨床條件，技術實施和分析能力仍是阻礙cfDNA應用推廣與普及的主要原因[19]。血樣中目標cfDNA的濃度極低且易降解是技術實踐困難的主要根源之一[20]。因此在每個技術環節需要詳細標準化設計并嚴格實行[7, 20]：為盡可能減少血液細胞釋放非目標cfDNA對目標cfDNA造成污染，需避免樣本發生溶血，發生溶血的樣本不適于用于cfDNA分析。通常條件下靜脈采血后應在1～4 h內分離出血漿。如果使用含有對血細胞有穩定作用添加劑的特殊采血管，樣本放存期限可以增加至7 d以上。通常應至少依次進行低速(如3000× g)和高速(如30 000 ×g)兩次離心除血細胞和游離長鏈DNA片段。分裝后-80 ℃凍存兩周內使用對cfDNA的影響最小。如使用專門提取cfDNA的商業化試劑盒可以在保留短片段DNA方面有所改進。血樣處理具體流程(如待處理時間、離心、溫度等因素條件)不同可能會引起不同分析結果的產生。就此值得一提的是，盡管不少cfDNA應用研發報道展示了突出的診斷能力，但其中技術流程的精確性、重復性等質控基礎是否充分以及是否具有可普及性，相較其數據結果，在報告中常常沒有受到應有的突顯。另外，在獲取cfDNA之后應采取何種分析或測序技術、何種測量指標，如何解讀指標結果，如何獲得臨床最優模型，這些也超出了臨床醫學目前專業教育的常規范圍，跨學科交叉技能是日常實現cfDNA檢測分析的必備基礎條件。此外，除了實驗室技術環節，研究設計也往往影響有關發現的實際臨床價值，如肝癌通常發生于當地多發慢性肝病肝硬化或嚴重肝纖維化階段，因此在評估肝癌識別指標時，應將這些臨床情況對應設計在對照隊列中，而非僅考慮將健康者作為研究對照，或對照隊列中大部分為健康者。從目前來看，本領域還需要更多在技術嚴謹性和臨床設計嚴謹性雙方面高質量的研究報道。