貴州部分地區規模豬場鏈球菌和多殺性巴氏桿菌的耐藥性分析

黃忍，張定練，肖馳

（廣東天農食品集團股份有限公司，廣東 清遠 511500）

豬鏈球菌病是由多種不同血清型鏈球菌（Streptococcosis suis，SS）感染引起的，主要以淋巴結膿腫、腦膜炎、關節炎及敗血癥狀為主要臨床特征[1]。通過莢膜抗原可將鏈球菌分為35個血清亞型，其中豬二型鏈球菌（Streptococcus suistypeⅡ，SS2）是豬體內最常分離到，也是致病力最強的菌株[2]。SS2不僅導致豬急性敗血癥、腦膜炎、關節炎、心肌炎和急性死亡的發生，且可感染人并致死，為人獸共患性傳染病。因此其不僅可給全球養豬業造成重大經濟損失，而且嚴重威脅食品安全和人類健康[3]。

多殺性巴氏桿菌是一種革蘭氏陰性小桿菌，通常存在于健康動物的上呼吸道中，被認為是一種機會性致病菌[4]。多殺性巴氏桿菌具有廣泛的感染宿主，可引起牲畜、家禽和野生動物的多種疾病，包括豬、牛、小反芻動物和兔子的肺炎、牛的急性敗血癥、家禽的禽霍亂和豬的萎縮性鼻炎[5]。此外，多殺性巴氏桿菌為人獸共患性傳染病原，嚴重時可導致人菌血癥的發生。多殺性巴氏桿菌主要引起豬萎縮性鼻炎和豬肺疫兩種疾病[6]。這兩種疾病均可導致豬生長緩慢和飼料轉化率降低，給養豬業造成巨大的經濟損失。

抗生素是治療這兩種疾病的有效方法，但由于抗生素的濫用，細菌極易產生耐藥性，導致治療的失敗。本研究對2021年從貴州省黔南州、遵義市、貴陽市三個地區7個規模化豬場分離到的4株多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌進行耐藥性分析，以期為這兩種病的有效防治及減少耐藥性的產生提供參考和依據。

1 材 料

1.1 菌株

試驗用豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌，從貴州省黔南州、遵義市、貴陽市三個地區7個規模化豬場的病死豬肺臟病料經分離鑒定獲得，菌株由貴州日泉農牧有限公司實驗室保存。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB），購自青島海博生物技術有限公司；豬鏈球菌2型熒光PCR檢測試劑盒和豬多殺性巴氏桿菌熒光PCR檢測試劑盒，購自廣州悅洋生物技術有限公司；青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、復方新諾明、克林霉素、多黏菌素B、氟苯尼考，購自杭州四季青公司。

1.3 主要儀器

PCR儀（CFX96 Touch），美國伯樂有限公司；超凈工作臺（PCR-2A），蘇潔醫療器械（蘇州）有限公司。

2 方法

2.1 菌種復蘇、革蘭氏染色鏡檢鑒定

將實驗室保存的菌種用含5%馬血清TSA培養基和血平板進行培養，培養條件為37℃、12～18 h。菌種復蘇后觀察菌落形態，進行革蘭氏染色鏡檢。

2.2 PCR鑒定

使用商業化試劑盒對分離菌株進行RT-PCR鑒定。

2.3 藥敏試驗

按美國臨床與實驗室標準化協會推薦的K-B法對分離菌株進行16種抗生素藥物敏感性試驗，試驗結果按照美國臨床與實驗室標準協會編制的抗微生物藥物敏感性試驗執行標準手冊[7]要求進行判讀。

3 結果與分析

3.1 菌落形態及染色鏡檢結果

4株菌株在血平板上呈現β溶血環，形成表面光滑、邊緣整齊、無色透明的針尖狀小菌落，且4株菌株革蘭氏染色鏡檢均為兩端鈍圓、單個、散在排列的陰性短桿菌（見圖1）。將這4株菌株分別命名為TN-1、TN-2、TN-3、TN-4。6株菌株在血平板上呈現α溶血環，形成表面光滑、邊緣整齊、乳白色小菌落，且6株菌株革蘭氏染色鏡檢均呈二聯或四聯革蘭氏陽性球菌。將這6株菌株分別命名TN-5、TN-6、TN-7、TN-8、TN-9、TN-10。

圖1 分離的革蘭氏陰性短桿菌（左）和革蘭氏陽性球菌（右）

3.2 分離菌qPCR檢測結果

采用豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌RTPCR檢測試劑盒對10株菌株進行RT-PCR檢測。檢測結果顯示，TN-1、TN-2、TN-3、TN-4為豬源多殺性巴氏桿菌，TN-5、TN-6、TN-7、TN-8、TN-9、TN-10為豬二型鏈球菌。

3.3 藥敏試驗結果

共檢測4株豬源多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌對9大類16種抗菌藥物的敏感性，藥敏試驗結果表1和表2。從表1可知，4株多殺性巴氏桿菌對克林霉素耐藥率為100%，對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、諾氟沙星的耐藥率為75%，耐藥情況十分嚴重。對青霉素、氨芐西林、多西環素、復方新諾明、氟苯尼考耐藥率為50%，耐藥情況較為嚴重。對多黏菌素B和頭孢類抗生素敏感。從表2可知，6株豬二型鏈球菌對青霉素、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、克林霉素、氟苯尼考完全耐藥，對氨芐西林、阿莫西林、諾氟沙星、復方新諾明和多黏菌素B耐藥較為嚴重。對三代頭孢頭孢曲松耐藥率為33.3%，現階段僅有三代頭孢較為敏感，多數菌株表現為多重耐藥。

表1 4株豬多殺性巴氏桿菌對14種抗生素的藥敏試驗結果

表2 6株豬2型鏈球菌對16種抗生素的藥敏試驗結果

4 討 論

隨著養豬規模不斷擴大，養豬大集團產能不斷增加，引種和生豬交易頻繁進行，將會增加疾病的發生率。并且疾病的發展也會越來越復雜，為了保證豬群的健康，預防和治療性用藥也會越來越頻繁[8]。雖然在一段時間、一定程度上對疫病起到了控制作用，但是很多時候的無效用藥和長期用藥都會增加耐藥菌株的產生。特別是母豬群出現大面積耐藥的情況下，保育、育肥至出欄的豬可選擇的藥物會越來越少。隨著耐藥性的增加和藥效的減弱，藥物使用劑量也會越來越大，成本也會增加。

本研究前期對貴州地區呼吸道疾病死亡和急性死亡豬只進行解剖采集肺臟組織。經過細菌分離、染色鏡檢、qPCR檢測等技術，發現了豬源多殺性巴氏桿菌和鏈球菌為致豬死亡的主要病原菌，對這幾個豬場而言，致病性細菌是引起呼吸道疾病和急性死亡的主要病原菌，其中又以豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌為主。

本研究對分離到的4株豬源多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌進行了藥敏檢測，發現均存在多重耐藥現象。4株豬源多殺性巴氏桿對β內酰胺類和多肽類藥物較為敏感，對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物嚴重耐藥，對青霉素類、四懷素類、磺胺類和酰胺醇類抗生物耐藥較為嚴重。6株豬二型鏈球菌對青霉素、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、克林霉素、氟苯尼考完全耐藥，對氨芐西林、阿莫西林、諾氟沙星、復方新諾明和多黏菌素B耐藥較為嚴重。三代頭孢頭孢曲松耐藥率為33.3%，現階段僅有三代頭孢較為敏感。多數菌株表現為多重耐藥。因此對豬二型鏈球菌而言，耐藥程度已經很高。

通過對這幾個養豬場的走訪發現，豬場長期并且僅使用大環內酯類的泰萬和泰樂菌素，青霉素類的青霉素和阿莫西林，β-內酰胺類的頭孢噻夫，酰胺醇類的氟苯尼考，林可胺類的克林霉素。并且上游母豬場也長期并且僅使用以上藥物。此外，發現這些豬場缺少獸醫的指導，缺乏針對性用藥策略，長期開大處方，長期低劑量長時間進行藥物保健。因此，一系列的不規范操作導致了豬場發生嚴重耐藥。在了解了豬場用藥和疾病背景的情況下，有針對性地開展了藥物敏感性試驗，同時確保豬群吃到足量的藥物是很關鍵的，長期低劑量使用藥物不僅達不到治療效果還會導致細菌耐藥的產生。

基于此案例，為了避免耐藥菌株的持續出現，豬場應該根據豬群的臨床癥狀，嚴格控制藥物的使用，通過藥物敏感試驗嚴格篩選敏感藥物用于疾病的預防和治療[9]。同時在日常管理中，加強豬場生物安全防控工作，做好豬群的免疫和免疫監測，提高豬群抵抗力，減少不良誘因繼發細菌性疾病的發生，降低經濟損失。