圈養大熊貓和小熊貓所食兩種新鮮竹葉的氣味及成分研究

鮮義坤，董超，楊波，武偉，張亞輝*，劉張育，馬黎民，張貴權*

（1.四川省自然資源科學研究院，成都 610041；2.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，成都 611830；3.中國大熊貓保護研究中心，成都 611830；4.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130；5.四川省動物采食調控工程技術研究中心，成都 611130；6.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118）

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）和小熊貓（Ailurus fulgens）分別為我國的一級和二級重點保護動物，在野外生存環境中同域分布，相互伴生，食性均已高度特化，都以竹類為主要食物，均食竹筍與竹葉，大熊貓還食竹稈，而小熊貓卻不食竹稈[1-2]，對不同竹種的食物都存在明顯的選擇性[2-4]。在人工飼養條件下，大熊貓和小熊貓除竹稈外同食一樣的窩窩頭、蘋果、胡蘿卜、竹筍和竹葉，僅每天飼喂量有所不同。因大熊貓和小熊貓頗具觀賞性和科研、科普價值，近些年人工飼養的數量、單位和地方越來越多。一些科研人員曾探索過圈養大熊貓選擇性攝食的氣味機理[5-7]，系統性研究過圈養大熊貓幼仔喜食的母乳、補飼奶粉，亞成體和成體所食的特制窩窩頭、新鮮果蔬類食物、多種新鮮竹類食物和不食的陰干斑苦竹葉等氣味特點及香氣成分[7-14]，但未見圈養小熊貓、刺黑竹葉和八月竹葉在這些方面的專門研究報道。

經攝食行為觀察，圈養大熊貓和小熊貓都要先嗅聞竹葉散發出的氣味，然后才取食或不取食，說明竹葉的氣味與圈養大熊貓和小熊貓是否愿意取食相關聯。本文通過專業人員的嗅感品評、頂空（HS）-固相微萃取（SPME）-氣相色譜（GC）-質譜（MS）聯用分析法研究圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉、八月竹鮮葉的氣味特點、揮發性有機物（VOCs）與典型香氣成分，以探尋大熊貓和小熊貓共同喜好的食物氣味特點，進一步挖掘大熊貓食物中的香氣物質，為研制大熊貓和小熊貓的竹葉誘食劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試竹種

刺黑竹（Chimonobambusa purpurea）當地俗稱牛尾竹，產于四川省崇州市文井江鎮，竹齡3年，葉齡1～2年。八月竹（Chimonobambusa szechuanensis）產于四川省汶川縣三江鎮，竹齡2年，葉齡2個月～1年。均經專家鑒定并確定學名，是中國大熊貓保護研究中心臥龍神樹坪基地和都江堰基地常喂大熊貓和小熊貓的竹種。

1.2 竹葉樣品的采集、制備、保存和運輸

2022年3 月下旬至7月初，先后在中國大熊貓保護研究中心臥龍神樹坪基地和都江堰基地進行圈養大熊貓和小熊貓的上述2種竹葉飼喂試驗，通過飼喂試驗現場隨機多點從竹枝上采集新鮮竹葉樣品，所采樣品可代表大熊貓和小熊貓所食的新鮮竹葉（以下簡稱鮮葉）。在鮮葉樣品采集和制備之前，所有與樣品接觸的用具用品須經反復清洗，達到干凈無味，以防其他氣味串入樣品。將多次采回的鮮葉樣品混合，從中隨機取出部分鮮葉，剪細，再混合，隨機分成2份，裝入自封塑料袋，分別用于氣味品評和HS-SPME-GC-MS聯用分析。制好的樣品密封保存于-18℃冰箱中。采集的大樣和制備的小樣分別在裝有冰袋的保溫箱和桶中運輸。

1.3 氣味品評方法

在同一天分別稱取刺黑竹和八月竹的鮮葉樣品各0.8 g，倒入干凈無味的50 mL玻璃燒杯中，每位專業品評小組成員（n=7）在不知樣品有關信息的情況下單獨嗅感并分辨竹葉自然散發出的多種氣味韻調及其相對強弱，品評的主要香氣指標參照Clive分類法的香氣類型設立[15]，室內氣溫為24℃，具體方法參見文獻[5-7]。相對強弱采用10分定義的標度方法計分：0=不存在的；2=微微的；4=輕微的；6=明確的；8=顯著的；10=非常顯著的[7-8]。每個品評指標的最終得分結果是去掉1個最高評分和1個最低評分后的算術平均數（n=5）。

1.4 HS-SPME-GC-MS聯用方法

1.4.1 分析儀器

GC-MS聯用儀（Agilent 7890B-5977B）、超高惰性石英毛細管色譜柱（HP-INNOWax、30 m×0.25 mm×0.25 μm）、20 mL頂空瓶及其相應的密封墊和鋁蓋，均由美國Agilent公司制造。SPME纖維頭（75 μm CAR/PDMS）和手動進樣手柄，均由美國Supelco公司制造。以上儀器設備由中國科學院成都分院分析測試中心GC-MS室提供。

1.4.2 HS-SPME方法

在同一天分別稱取刺黑竹和八月竹的鮮葉樣品各1.5 g，置于20 mL頂空瓶中，在70℃的條件下頂空萃取1 h。具體方法參見文獻[5]。

1.4.3 GC-MS方法

GC條件：進樣口溫度為250℃，載氣為高純氦氣，柱流量為0.80 mL·min-1，進樣模式為分流，分流比為5∶1。程序升溫模式：起始溫度45℃，保持3 min，以5℃·min-1速率升至180℃，然后再以8℃·min-1速率升至260℃，保持10 min。MS條件及其數據處理同文獻[9]的方法二。

1.5 數據統計分析

所得數據使用GranphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 氣味的嗅感品評

2.1.1 整體氣味指標

經專業人員的品評打分，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的3個整體氣味指標得分“均值±標準誤”見圖1。

由圖1可知，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉共有的整體氣味特點為：氣味較濃，愉悅度較高，透發性較強。經t檢驗，刺黑竹鮮葉的氣味強度和愉悅度均顯著低于八月竹鮮葉（P＜0.05），刺黑竹鮮葉的氣味透發性雖然低于八月竹鮮葉，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 兩種竹子鮮葉整體氣味指標的品評得分

2.1.2 主要香氣指標

經專業人員的品評打分，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的4個香氣指標得分“均值±標準誤”見圖2。

由圖2可知，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉共有的主要香氣特點為：青香顯著，均有輕微的甜氣、微微的木香和很弱的油脂氣。雖然刺黑竹鮮葉的青香、甜氣低于八月竹鮮葉，但刺黑竹鮮葉的木香、油脂氣高于八月竹鮮葉，除刺黑竹鮮葉的木香顯著高于八月竹鮮葉（P＜0.05）外，其余3種香氣的差異均不顯著（P＞0.05）。

圖2 兩種竹子鮮葉主要香氣指標的品評得分

2.1.3 主要韻調指標

經專業人員的品評打分，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的3個韻調指標得分“均值±標準誤”見圖3。

由圖3可知，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉共有的主要韻調特點為：新鮮感顯著，均有明顯的多汁感和不同程度的嫩感。刺黑竹鮮葉的新鮮感、多汁感、嫩感均明顯低于八月竹鮮葉，其中新鮮感和多汁感的差異顯著（P＜0.05），嫩感的差異達到極顯著水平（P＜0.01）。

圖3 兩種竹子鮮葉主要韻調指標的品評得分

2.2 VOCs

刺黑竹和八月竹的鮮葉樣品散發出的VOCs經HS-SPME-GC-MS聯用法分析后，總離子流色譜圖分別見圖4和圖5。

圖4 圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉的VOCs總離子流色譜

從圖4與圖5的相互對比可以看出，刺黑竹鮮葉與八月竹鮮葉之間的出峰時間多數相同，但波峰大小有所差異，說明這2種鮮葉的VOCs成分有些相同，但相對含量有所不同。解譜后的具體成分及其相對含量詳見表1。

圖5 圈養大熊貓和小熊貓所食八月竹鮮葉的VOCs總離子流色譜

由表1可知，從刺黑竹和八月竹的鮮葉中測出的VOCs成分總數分別為53種和62種，這些VOCs成分及其相對含量各自歸屬于有機化合物的類別見表2。

表1 圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉與八月竹鮮葉中的VOCs %

由表2可知，從刺黑竹和八月竹的鮮葉中分別測出了8類和9類有機化合物。按每個類別測出的成分種數多少排序，前3位的類別在刺黑竹鮮葉中分別是醛類、醇類、酮類；在八月竹鮮葉中分別是烯烴類、醇類、醛類。按儀器自動算出的每類相對含量多少排序，前3位的類別在刺黑竹鮮葉中分別是醛類、醇類、酮類；在八月竹鮮葉中分別是醇類、烯烴類、醛類。由上可知，刺黑竹鮮葉與八月竹鮮葉之間在有機化合物類別的數量、各類的成分種數和相對含量上均存在或多或少的差異，可能因竹種、葉齡、產地等不同所致。

表2 刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉中VOCs的類別及其成分種數與相對含量統計

續表1圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉與八月竹鮮葉中的VOCs %

續表1圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉與八月竹鮮葉中的VOCs %

2.3 典型香氣成分

典型香氣成分是指我國或/和歐盟、美國、日本法規許可的食品級單體呈香物質，并非所有的VOCs或具有氣味的VOCs。從刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉測出的VOCs中挑選出的典型香氣成分詳見表1中VOCs名稱后面帶☆者和△者。據統計，刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉分別有44種和45種典型香氣成分，占各自VOCs成分總數的83.02%和72.58%，說明在這2種竹子鮮葉中大多數的VOCs屬于典型香氣成分，這可能是氣味強度較大和香氣類型豐富的物質基礎。這些典型香氣成分及其相對含量各自歸屬于有機化合物的類別見表3。

表3 刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉中典型香氣成分的類別及其成分種數與相對含量統計

由表3可知，從刺黑竹和八月竹的鮮葉中測出的典型香氣成分分別有7類和8類有機化合物。按每個類別測出的典型香氣成分種數多少排序，前2位的類別在刺黑竹鮮葉中分別是醛類和醇類，這2個類別的成分數量之和達22種，在典型香氣成分總數中占比50%；在八月竹鮮葉中分別是醇類和醛類，這2個類別的成分數量之和為20種，在典型香氣成分總數中占比44.44%。按儀器自動算出的每類相對含量多少排序，前2位的類別在刺黑竹鮮葉中分別是醛類和醇類，這2個類別的相對含量之和達60.24%；在八月竹鮮葉中分別是醇類和醛類，這2個類別的相對含量之和達54.94%。由上可知，無論成分種數還是累計的相對含量，醛類和醇類典型香氣成分是刺黑竹和八月竹鮮葉中香氣類型及其相對強度的主要貢獻物質類別。刺黑竹和八月竹的鮮葉中相對含量排前10位的典型香氣成分見表4。由表4可知，在相對含量排前10位的典型香氣成分中刺黑竹和八月竹的鮮葉之間有5種相同成分，分別是反式-2-己烯醛、2-乙基呋喃、3-己烯-1-醇、反式,反式-2,4-己二烯醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛，這些相同成分是這2種鮮葉具有相同香氣類型的物質基礎，其累計相對含量分別達到38.18%和41.03%，預示八月竹鮮葉的氣味強度應高于刺黑竹，與專業人員的品評結果相符（見圖1）。其余為互不相同的成分，可能因為竹種、葉齡、產地等不同所致，可引起各香氣類型的強度差異。

表4 刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉中相對含量排前10位的典型香氣成分異同

3 討 論

3.1 刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉香氣形成的物質原由

綜上所述，本研究不僅通過專業人員對圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的整體氣味特點、主要香氣特點、主要韻調特點進行了品評，而且使用與氣味物質測定相匹配的HSSPME-GC-MS聯用法分析了這2種竹子鮮葉的VOCs，尤其是典型香氣成分，進而以儀器分析的結果來證實專業人員的嗅感品評結果。盡管某些典型香氣成分及其有機化合物類別的測定可能還不完全，但或多或少能說明這2種竹子鮮葉香氣形成的直接物質原由。由表1可知，某種單一典型香氣成分可呈現多種香氣[16-19]，圖2中的主要香氣可從表1單一典型香氣成分的主要香氣特征中找到相應的多種支撐物質，因此這2種竹子鮮葉散發出的某種香氣并非由一種典型香氣成分形成，而是由多種典型香氣成分在呈香相互作用（協同增效或抵消減弱[20]）后的最終嗅感結果。某種香氣及其強度與典型香氣成分的種數多少、含量和嗅感閾值高低密切相關[15]。由表1可知，與青香相關的典型香氣成分在刺黑竹鮮葉中測出了24種，相對含量累計為55.86%；在八月竹鮮葉中測出了23種，相對含量累計為71.54%；無論典型香氣成分種數還是累計的相對含量在這2種竹子鮮葉品鑒出的4種香氣類型中最多，故青香最強，與圖2的品評結果相符；雖然刺黑竹鮮葉中測出的典型香氣成分種數比八月竹鮮葉多1種，但累計的相對含量卻少15.68個百分點，這可能是刺黑竹鮮葉的青香不及八月竹鮮葉濃的原因。與甜氣相關的典型香氣成分在刺黑竹鮮葉中測出了14種，相對含量累計為23.17%；在八月竹鮮葉中測出了13種，相對含量累計為27.60%；測出的典型香氣成分種數和累計相對含量在這2種竹子鮮葉品鑒出的4種香氣類型中均位居第二，故甜氣的濃度在這2種竹子鮮葉中均排名第二，也與圖2的品評結果相符；雖然刺黑竹鮮葉中測出的典型香氣成分種數比八月竹鮮葉多1種，但累計的相對含量卻少4.43個百分點，這可能是八月竹鮮葉的甜氣比刺黑竹鮮葉強的原因。與木香相關的典型香氣成分在刺黑竹鮮葉中測出了9種，相對含量累計為20.68%；在八月竹鮮葉中測出了8種，相對含量累計為23.46%；測出的典型香氣成分種數和累計相對含量在這2種竹子鮮葉品鑒出的4種香氣類型中均位居第三，故木香的濃度在這2種竹子鮮葉中均排名第三，同樣與圖2的品評結果相符；雖然刺黑竹鮮葉中測出的典型香氣成分種數比八月竹鮮葉多1種，而累計的相對含量少2.78個百分點，似乎八月竹鮮葉中的木香比刺黑竹鮮葉強，這與專業人員的品評結果不一致，但刺黑竹鮮葉中與木香相關的反式-β-紫羅蘭酮相對含量最高（4.77%，見表1），其香氣閾值為0.007 μg·kg-1[15]；而八月竹鮮葉中與木香相關的β-羅勒烯相對含量最高（16.54%，見表1），其香氣閾值為34 μg·kg-1[21]，即反式-β-紫羅蘭酮的香氣閾值是β-羅勒烯的4 800余倍，香氣閾值越低，香勢越強[15]，極大地提升了刺黑竹鮮葉中木香的嗅感品評結果，因此刺黑竹鮮葉中的木香比八月竹鮮葉強；供試刺黑竹鮮葉的葉齡比供試八月竹鮮葉的葉齡大，葉齡越大，木質化程度越高，木香就越強，這也佐證了刺黑竹鮮葉中的木香比八月竹鮮葉強。如前所述，在典型香氣成分的有機化合物類別方面，醛類和醇類典型香氣成分是刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉氣味的主要貢獻物質類別，與文獻[6-7]報道的圈養大熊貓所食毛竹、牛兒竹、硬頭黃竹、清甜竹、孝順竹、斑苦竹等6種鮮葉結果一致。

3.2 圈養大熊貓和小熊貓攝食新鮮竹葉的主要氣味指標適宜范圍

綜上所述，刺黑竹鮮葉的氣味強度、愉悅度、透發性、青香、甜氣、新鮮感、多汁感和嫩感均低于八月竹鮮葉，而刺黑竹鮮葉的木香和油脂氣均高于八月竹鮮葉，其中氣味強度、愉悅度、木香、新鮮感和多汁感的差異顯著（P＜0.05），嫩感的差異極顯著（P＜0.01），這些差異可能因為供試刺黑竹鮮葉的葉齡1～2年大于供試八月竹鮮葉葉齡2個月～1年所致。盡管2種供試竹子鮮葉的部分指標之間存在明顯差異，但圈養大熊貓和小熊貓均在嗅聞這2種竹子鮮葉的氣味后取食，說明圈養大熊貓和小熊貓對竹子鮮葉的一些氣味指標都有一定范圍的包容性。當鮮葉變干至葉片卷曲并變色時，不再被圈養大熊貓和小熊貓所取食，因為竹葉變干的過程既是一個失水的過程，也是一些優勢氣味韻調散失的過程[7]。結合對斑苦竹鮮葉的氣味品評得分結果[7]，圈養大熊貓和小熊貓攝食新鮮竹葉的主要氣味指標適宜范圍如下：氣味強度7.80～8.60，氣味愉悅度7.05～8.60，氣 味 透 發 性6.90～8.40，青 香7.50～8.10，甜氣4.30～5.40，木香（木質氣）2.20～4.00，新鮮 感6.40～8.20，多 汁 感4.85～6.60，嫩 感3.20～6.00。這些氣味指標的組合構成了新鮮竹葉對圈養大熊貓和小熊貓的誘食性。

3.3 圈養大熊貓和小熊貓喜好的竹葉香氣韻調特點

對圈養大熊貓和小熊貓攝食竹葉行為的觀察結果表明，圈養大熊貓和小熊貓與刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉之間的關聯是通過這2種鮮葉自身散發出的氣味來傳遞有效信息才得以實現，這是長期自然選擇和協同進化的結果。竹葉的氣味可向圈養大熊貓和小熊貓傳遞安全性、可食性、營養性等有效信息，被圈養大熊貓和小熊貓嗅覺感知并獲得認同后才可能繼發取食竹葉的行為。圈養大熊貓和小熊貓所食的刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉氣味強度較大，利于他們嗅感，愉悅度較高可能預示鮮葉的安全性較高，透發性較強說明鮮葉氣味的擴散性較好，顯著的青香和新鮮感、明顯的多汁感、輕微的甜氣、微微的木香以及不同程度的嫩感可能構成鮮葉的可食性，并表征鮮葉的營養性，這些香氣韻調組合在一起形成了刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉特有的優勢香氣韻調。結合此前對圈養大熊貓幼仔喜食的母乳[8]、2種補飼奶粉[11]、亞成體和成體所食的特制窩窩頭[12]、新鮮玉米秸稈[5]、新鮮蘋果和胡蘿卜[13]、6種新鮮竹稈[22]和竹葉[6-7]、2種新鮮竹筍[14]以及不食的陰干斑苦竹葉的氣味特點研究結果[7-14]，認為圈養大熊貓和小熊貓喜歡刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的香氣韻調有青香、甜氣、新鮮感。顯著的青香和新鮮感、輕微的甜氣等是誘導圈養大熊貓和小熊貓取食刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的主要香氣韻調。

3.4 應用建議

目前，我國尚無人工飼養大熊貓和小熊貓的食物添加劑要求或標準。若要研制大熊貓和小熊貓的竹葉誘食劑，所用原料應遵循“從食物中來，到食物中去”的安全原則。從刺黑竹鮮葉中發現的2-戊酮、d-檸檬烯、α-松油醇、十四酸和從八月竹鮮葉中發現的2-庚醇、反式-2-丁烯酸葉醇酯、反式，順式-3,6-壬二烯-1-醇、十四酸是圈養大熊貓所食其他6種竹葉中未曾被測出的單體呈香物質[6-7]，擴大了竹葉誘食劑的可選單體香料范圍。研制竹葉誘食劑時，可參照刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的整體氣味指標（見圖1）、主要香氣指標（見圖2）和主要韻調指標（見圖3），酌情酌量選用表1中帶☆號和文獻[6-7]已報道的典型香氣成分單體物質，模擬新鮮竹葉的氣味特點進行調配香精，方可具有良好的誘食效果。

4 結 論

本研究表明，圈養大熊貓和小熊貓所食刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉的共同氣味韻調特點為：氣味較濃，愉悅度較高，透發性較強，青香顯著，均有輕微的甜氣和微微的木香，顯著的新鮮感，明顯的多汁感和不同程度的嫩感。從刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉中分別發現了44種和45種典型香氣成分，醛類和醇類典型香氣成分是刺黑竹鮮葉和八月竹鮮葉氣味的主要貢獻物質種類。這有助于探究圈養大熊貓和小熊貓攝食的氣味機理和研發其竹葉誘食劑。

致謝：本研究的氣味品評在成都大帝漢克生物科技有限公司/四川省動物采食調控工程技術研究中心進行，喻麟董事長和李小兵總經理給予了支持，李松柏高級工程師、鄧虹高級工程師、黃明亞工程師以及西華大學食品與生物工程學院的包清彬教授參加了氣味品評，吳勁旭老師核定了供試竹種的學名，臥龍神樹坪基地的曾文等同仁，都江堰基地的瞿桂英、廖友平等同仁在圈養大熊貓和小熊貓的飼喂試驗與竹葉采樣時積極配合，中國科學院成都分院分析測試中心的胡靜副研究員在揮發性成分分析與推定方面提供了幫助，在此一并深表謝意！