肝內膽汁淤積癥血清膽汁酸譜的特征及研究進展

朱時帥 蘆曦

膽汁淤積性肝病是指由于各種原因造成的膽汁形成、分泌和排泄障礙，從而導致膽汁流動中斷，疏水膽汁酸和其他代謝物在肝臟積聚的病理綜合征，根據部位可將其分為肝內及肝外膽汁淤積兩種類型。其中，大多數膽汁淤積性疾病是由于肝細胞功能障礙或毛細膽管、細膽管、小葉間膽管病變所致的肝內膽汁淤積[1]。

由于診斷標準未完全統一，膽汁淤積性肝病的發生率尚無準確的數據。2015年曹旬旬等[2]的流行病學調查結果顯示，在4660例慢性肝病患者中，膽汁淤積癥的患病率為10.26%。膽汁淤積性肝病患者早期可無明顯不適，臨床上多表現為乏力、惡心、上腹不適等非特異性癥狀。目前，血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和谷氨酰轉肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)升高是膽汁淤積最具特征性的早期表現[3]。膽汁酸在肝內合成及分泌，血清總膽汁酸水平升高亦是早期反映膽汁淤積性肝病的一個敏感的經典指標。既往由于其影響因素較多，很大程度上限制了血清膽汁酸的臨床應用，故目前國內外相關指南均未將血清總膽汁酸列入診斷標準。隨著檢驗技術的發展，我們發現血清膽汁酸譜的變化而不是總膽汁酸水平，與肝內膽汁淤積性肝病的發生、發展具有一定的相關性，有可能取代血清總膽汁酸成為新的實驗室檢查指標且有更廣泛的臨床應用價值。本文對膽汁酸譜的影響因素以及肝內膽汁淤積癥患者中膽汁酸譜的特征性變化的病理生理基礎進行綜述，提示血清膽汁酸譜在肝內膽汁淤積癥中的臨床應用前景。

一、膽汁酸譜分類及代謝

膽汁酸是膽固醇代謝的最終產物[4]，其在維持肝臟的功能、代謝調節、肝生理學方面起著重要的作用。然而，作為一種兩性分子，疏水性膽汁酸可以損傷正常肝細胞膜，導致肝臟損傷。

(一) 膽汁酸合成 在肝臟中，由膽固醇在細胞色素酶家族(cytochrome P，CYP)的作用下通過經典途徑(90%)和替代途徑(10%)生成初級膽汁酸——膽酸(Cholic Acid，CA)、鵝脫氧膽酸(chenodesoxycholic acid，CDCA)。CA和CDCA一旦合成，即可與牛磺酸和甘氨酸迅速結合形成初級結合膽汁酸。進入腸道后，在腸道菌群水解、脫羥基作用下，初級結合膽汁酸轉變為次級游離膽汁酸，主要包括脫氧膽酸(desoxycholic acid，DCA)與石膽酸(lithocholic acid，LCA)[5]。大約95%的膽汁酸通過結腸末端的特定轉運體重新吸收并轉運到肝臟，這個過程被稱為膽汁酸的腸肝循環[6]。在人體腸道中，CYP3A和CYP2家族酶也能將LCA代謝成更易溶解、毒性更低的豬膽酸(hyocholic acid，HCA)和熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid， UDCA)。

(二)膽汁酸轉運

1.肝臟膽汁酸轉運：在血漿生理pH下，膽汁酸鹽主要通過肝細胞基底膜上的鈉離子依賴性牛磺酸轉運蛋白(taurocholic acid cotransport peptide，NTCP)、非鈉離子依賴性有機陰離子轉運子家族(organic anion transporter，OATPs)被肝細胞攝取[7-8]，其中，NTCP負責大部分膽汁酸的吸收，而OATPs負責部分游離膽汁酸或甘氨酸結合二羥基膽汁酸的吸收，約占肝細胞膽汁酸攝取的25%。

膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)和多藥耐藥相關蛋白-2(multidrug resistanceassociated protein-2，MRP2)是毛細膽管膜上主要的膽汁酸外流轉運體，介導膽汁酸分泌進入膽汁。此外，肝細胞基底膜上的有機溶質轉運蛋白(organic solute transporter，OST)Ostα和Ostβ異二聚體可以介導膽汁酸分泌進入體循環，通過腎臟排泄[7, 9]。在膽管中，結合膽汁酸則可通過頂端鈉離子依賴性膽鹽轉運蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT)進入膽管細胞，并通過膽管細胞基底膜上的Ostα/β異源二聚體分泌到膽管周圍叢，在膽汁形成中起一定作用。

2.腸道膽汁酸轉運：腸道膽汁酸的重吸收主要發生在回腸末端。在腸道黏膜細胞頂端膜上的ASBT，是人類最主要的腸內膽汁酸鹽回收系統[10]。Ostα和Ostβ在回腸細胞基底外側膜形成功能性異二聚體，介導膽汁酸外流進入門靜脈循環，同時，多藥耐藥相關蛋白-3(multidrug resistance associated protein-3，MRP3)在回腸末端高度表達，為膽汁酸鹽進入門靜脈循環提供了通路[11]。

二、影響膽汁酸代謝的因素

(一)膽固醇穩態 膽固醇是膽汁酸的合成原料。研究表明，肝臟中膽固醇主要通過四個方面輸入：①通過低密度脂蛋白受體介導的細胞內吞作用吸收血清中的膽固醇酯；②通過選擇性吸收高密度脂蛋白使膽固醇從外周組織反向轉運入肝臟；③通過低密度脂蛋白受體介導機制吸收腸道中的食物膽固醇作為乳糜微粒轉運入肝；④由乙酰輔酶A合成膽固醇[12]。以上通路出現障礙均會導致膽固醇的含量變化，進而影響膽汁酸的合成。

(二)基因缺陷 從膽固醇合成膽汁酸需要修飾膽固醇核和氧化膽固醇側鏈。常見的膽汁酸合成基因缺陷主要有3β-脫氫酶缺乏癥、5β-還原酶缺乏癥、CYP7A1缺陷、CYP7B1突變、CYP8B1突變等類型[13]。此外，編碼膽汁酸轉運蛋白的基因突變也可導致遺傳性膽汁淤積。

(三)肝細胞極性 肝細胞極性是膽汁酸動態平衡的另一個關鍵因素。肝細胞極性調節機制復雜，其中，緊密連接(Tight Junction，TJs)在維持黏膜上皮屏障和通透性方面起重要作用。在膽道疾病的許多病理改變中，均可以觀察到TJs屏障功能的喪失和膽汁酸誘導的細胞損傷[14]。

(四)核受體 核受體(nuclear receptors，NRs)是由配體激活的轉錄因子，它們在胚胎發生、發育和新陳代謝中起著重要作用，其中，多種NRs參與調控膽汁酸的合成和代謝。

法尼醇X受體(farnesoid X receptor，FXR)在肝細胞和腸道中高度表達，可以被膽汁酸激活。疏水性膽汁酸CDCA是FXR最有效的配體[15]。FXR的激活可導致CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1等細胞色素酶的轉錄抑制，從而在膽汁酸合成的負反饋調節中發揮核心作用，減少了膽汁酸的合成[1]。同時，FXR的激活除了抑制肝臟膽汁酸的合成外，還通過調節膽汁酸轉運蛋白的表達，抑制肝臟膽汁酸的攝取，促進膽汁酸的分泌，從而防止膽汁酸在肝細胞內積聚[16, 17]。

此外，孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)和構成型雄烷受體(constitutive Androstane receptor，CAR)以及維生素D3受體(vitamin D receptor，VDR)可以參與調控CYP家族酶、結合酶和轉運蛋白的表達，從而增加膽汁酸的結合力以及促進膽汁酸排泄[18- 19]。膽固醇可以誘導膽固醇7α羥化酶的表達，而這種底物介導的誘導過程是通過肝臟X受體(liver X receptor，LXR)實現的[20]。G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor，TGR5)是一種由膽汁酸激活的膜受體，可被多種膽汁酸激活，如LCA、DCA、CDCA和CA，并影響膽汁酸穩態[21]。

(五)腸道菌群 初級膽汁酸在腸道菌群的作用下經過水解、脫羥基等反應生成次級膽汁酸，而相關細菌的減少可能會導致微生物區系轉化活性降低，進而上調初級BAs的水平，下調次級BAs的水平[22]。腸道菌群的另一個重要作用是參與膽汁酸的異構化，從而改變膽汁酸的疏水性和毒性，保護肝臟免受更多有毒、疏水的膽汁酸的傷害[23]。此外，腸道菌群對肝臟膽汁酸合成及轉運也有調節作用[15]。

三、肝內膽汁淤積癥中膽汁酸譜的特征

(一)肝細胞性膽汁淤積 肝細胞性膽汁淤積包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎或酒精性肝炎、藥物性肝炎、遺傳性疾病、妊娠期肝內膽汁淤積癥、敗血癥或毒血癥、浸潤性疾病、紅細胞生成性原卟啉癥等。本文將對其中幾種疾病中膽汁酸譜的特征進行綜述。

1.酒精性肝病：多項研究發現，酒精性肝病患者血清中膽汁酸譜以CA和CDCA增高、牛磺酸結合膽酸(taurine-conjugated cholic acid，TCA)和牛磺酸結合脫氧膽酸(taurine-conjugated deoxycholic acid，TDCA)下降為主。長期酗酒可破壞細胞屏障功能，酒精通過抑制肝細胞膜 Na+-K+-ATP 酶活性及改變質膜的流動性, 使肝臟攝取Na+依賴性膽汁酸鹽減少，影響膽汁酸的分泌，這可能是導致CA和CDCA含量增高的原因[24]。同時，酒精可以改變腸道菌群的組成，酒精性肝病患者體內次級膽汁酸減少，或與腸道菌群 7α -脫羥酶活性降低有關[24]。此外，酒精性肝病患者吸收不良，這可能使腸道中菌群發生變化[25]，甘氨酸水解酶相關菌群數量增加，從而導致CA、DCA等游離膽汁酸濃度明顯上升，而TCA和TDCA等濃度下降。而由于結合膽汁酸減少，FXR活性降低，FXR/FGF15通路受到抑制，導致血清中總膽汁酸水平進一步增加[26]。

2.代謝相關性脂肪性肝病：有研究認為，代謝相關性脂肪性肝病(metabolism-related fatty liver disease，MAFLD)患者肝臟功能受損，使膽汁酸經肝血竇進入血液內的量增加，而為了維持其正常的膽汁酸腸肝循環, 不得不增加腸肝循環的次數,隨著腸肝循環的增加, 又使進入血液中的膽汁酸增多。多項研究表明，MAFLD患者NTCP表達減少，此外，患者體內FXR活性被抑制，對CYP7A1抑制減少，同時FGF19水平降低，導致膽汁酸升高[15]。除膽汁酸受體與轉運子改變外，MAFLD患者腸道菌群豐度及數量也發生了變化，牛磺酸代謝細菌增多[27]。以上改變可導致MAFLD患者中總膽汁酸水平變化以次級膽汁酸和結合膽汁酸含量升高為主，其中牛磺酸結合鵝脫氧膽酸(taurine-conjugated chenodeoxycholic acid，TCDCA)升高最為明顯。

3.妊娠期肝內膽汁淤積癥：相關研究表明，在妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)患者中存在多種膽汁酸轉運蛋白及膽汁酸代謝相關受體的基因缺陷。其中，編碼MDR3的ABCB4基因缺陷被認為在ICP的發病機制中起主要作用[28]。另一種較為重要的基因是編碼BSEP的ABCB11，其第444位氨基酸被替代可導致BSEP蛋白水平降低，從而導致ICP[28]。此外，還檢測到存在于膽管膜內的FIC1基因(ATP8B1)和FXR基因(NR1H4)的罕見突變[29]，從而導致FXR減少。

除遺傳因素外，妊娠相關激素也可影響ICP患者中膽汁酸的代謝。隨著妊娠的進展，血清中孕酮硫酸化代謝產物逐漸升高，其中，硫酸表烯丙孕酮(Epiallopregnanolone Sulfate)PM5S可作為FXR的部分激動劑，減少FXR的反式激活，抑制BA介導的BSEP的表達，導致肝細胞中膽汁酸的積聚[30]。此外，PM5S與另一種孕酮代謝物硫酸別孕酮PM4S均可降低NTCP含量，從而減少牛磺膽酸鹽在肝細胞中的攝取[31]。雌二醇也在ICP中發揮作用，其可以激活雌激素受體α，與FXR直接作用，降低FXR的活性，抑制BSEP的轉錄，并促進CYP7A1的表達[32]。最新研究表明，在妊娠晚期，FGF15、小二聚體伴侶(small heterodimer partner，SHP)和回腸膽汁酸結合蛋白(ileum bile acid binding protein，IBABP)的mRNA在回腸中的表達大大降低，而使用FXR激動劑GW4064治療可以改善其表達[33]，這進一步證明了ICP患者對FXR通路的影響。

多項研究表明，ICP患者可以檢測到CA的特征性上升和CDCA的下降，導致CA/CDCA比率的顯著升高，同時，TCA和TCDCA升高，甘氨酸/牛磺酸結合膽汁酸比例降低[34]。

4.遺傳性膽汁淤積性肝病：多種遺傳性疾病是膽汁淤積的重要病因，其中，進行性家族性肝內膽汁淤積(progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC)可導致血清膽汁酸譜的變化。根據血清中GGT升高程度PFIC可以分為兩組。在低GGT水平PFIC中，主要包括ATP8B1(PFIC1)、ABCB11(PFIC2)或TJP2(TJP2缺乏)三種基因缺陷，其中ABCB11主要編碼BSEP，TJP2蛋白與細胞定位缺陷和緊密連接結構的破壞有關，以上突變均可使膽汁酸無法分泌進入膽汁[35]。高GGT水平PFIC即為PFIC3，由編碼磷脂轉運體MDR3的ABCB4基因突變引起，其膽汁酸可以分泌進入膽汁，然而伴有磷脂分泌障礙及膽汁流出障礙，從而引起膽汁淤積[36]。因此，PFIC中膽汁酸譜變化以CA和CDCA升高為主。

(二)膽管細胞性膽汁淤積 膽管細胞性膽汁淤積主要疾病和病因有原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)、囊性纖維化、重疊綜合征、移植物抗宿主病、藥物性膽管病和繼發性膽管性硬化癥。其中，發病率最高的是PBC和PSC。

1.原發性膽汁性膽管炎：研究表明，PBC患者中膽汁酸含量增高，以甘氨酸結合鵝脫氧膽酸(glycine-conjugated chenodeoxycholic acid，GCDCA)和甘氨酸結合膽酸(glycine-conjugated cholic acid，GCA)升高為主[34]。PBC患者中存在多種參與膽汁酸代謝的轉運體表達或定位異常。Takeyama等[37]發現，在早期PBC患者中，MRP2的mRNA表達水平明顯增高。Kojima等[38]發現，部分晚期PBC患者MRP2表達分布紊亂，其回撤至細胞內，而并非定位于肝細胞膽管側細胞膜上。以上轉運體異常均可導致膽汁酸從膽管分泌受阻，從而可能會導致PBC患者血清中初級膽汁酸升高。同時，由于肝細胞膽汁酸分泌受損，可誘發基底外側膽汁酸外流作為其保護機制，而在膽管中，部分膽汁酸也可被膽管細胞吸收，并通過基底外側膜上的OSTα/OST β異二聚體分泌到體循環[39]。此外，在PBC前期，毛細膽管和肝內膽管阻塞，后期累及上游肝細胞緊密連接損傷，緊密連接完整性破壞，可使細胞膜的通透性增加，進一步導致PBC患者血清中初級膽汁酸升高，其水平變化可能與病情進展有關。另有研究發現，作為膽汁酸增多的代償機制，PBC患者BSEP蛋白及mRNA水平均升高，但具體效應尚不明顯[40]。

此外，現有研究表明，PBC患者血清初級/次級膽汁酸比值增高。一方面，在膽汁淤積性肝病中，流入小腸的膽汁減少導致次級膽汁酸生成減少，而初級膽汁酸由于前文所述的原因大量增加；另一方面，PBC患者中介導膽汁酸水解、脫羥基的微生物代謝受損，從而導致次級膽汁酸合成減少[41]。實驗表明，PBC患者血清中DCA、LCA和TLCA顯著低于健康對照組[41]。

2.原發性硬化性膽管炎：膽汁酸是PSC的重要標志物。有研究發現，PSC患者中總膽汁酸水平、初級/次級膽汁酸水平均增高，這可能與腸道菌群密切相關。PSC患者腸道菌群多樣性減少，且可以產生水解酶、脫羥基酶的細菌豐度下降，可導致次級膽汁酸生成減少[42]。然而，也有研究發現，經過萬古霉素治療的PSC患者體內次級膽汁酸減少，初級膽汁酸增高，而萬古霉素治療的目標是革蘭氏陽性菌，其主要參與初級膽汁酸的脫羥基化，這一發現則證明PSC患者中次級膽汁酸增高[43]。由于相關研究較少，尚無法證明相關研究的正確性。

除了腸道菌群的改變外，在PSC患者中還發現了多種轉運蛋白的改變。多項研究表明，PSC患者OSTα/OSTβ、BSEP和MRP3的表達明顯上調，同時，多種核受體，特別是FXR、PXR等表達也上調[44]，從而作為代償機制影響了膽汁酸的合成與代謝。

綜上，在肝內膽汁淤積性疾病的診斷中，前提需確定膽汁淤積的存在，目前主要依賴血清學指標，在膽汁淤積性疾病的早期并無黃疸，依賴GGT和AKP其敏感性較差，如PFIC 1和2型及BRIC等患者可無GGT升高，但其膽汁酸譜變化較為明顯。現階段關于血清膽汁酸譜的研究主要集中在酒精性肝病、代謝性肝病、PBC及ICP。我們發現，在疾病同質性的前提下，如遺傳代謝性肝病、PBC和ICP，其膽汁酸譜的變化與疾病的進展及預后密切相關，提示其作為一個經典的血清學指標，可能在鑒別膽汁淤積、高膽紅素血癥和血液系統疾病及病情進展中有更為廣闊的前景。

四、總結與展望

肝內膽汁淤積癥的診斷和治療始終是臨床中的難點，膽汁酸全程參與其病理生理過程，本文綜述了影響膽汁酸代謝的相關因素，以及不同肝內膽汁淤積疾病膽汁酸譜的特征性表現及相關機制，肯定了膽汁酸譜作為肝內膽汁淤積癥的標志物的可靠性。但目前尚缺少對疾病進展中膽汁酸譜變化的動態觀察。未來的研究可以著眼于進一步明確不同肝內膽汁淤積癥中膽汁酸譜的特征，從而確定不同種類肝內膽汁淤積癥發生、發展與膽汁酸譜的相關性，為進一步通過血清膽汁酸譜診斷疾病、判斷病情嚴重程度及預后提供實驗依據和線索，并為治療提供新的靶點和思路。