淺析口蹄疫阻斷ELISA 試驗中易出現的問題及其糾正措施

徐振浩，王巖梅

（山東省青島市即墨區動物疫病預防與控制中心，山東 青島 266200）

ELISA 試驗是目前基層獸醫實驗室經常使用的檢測方法，常用于口蹄疫、豬瘟等疫病的抗體效價測定，以及口蹄疫病、豬瘟等疫病的流行病學的調查、疫病診斷、防疫檢測、免疫程序制定等工作中。該試驗操作要求取量精確，操作熟練，讀數及時，試驗環境溫度適宜恒定，儀器設備計量準確等。在試驗操作過程中，稍有失誤就會使試驗結果出現偏差，試驗數據不準確或試驗失敗。筆者通過長期的檢測工作，總結了試驗中易出現的問題，并提出糾正措施，供實驗室人員參考。

1 人員方面易出現的問題

1.1 操作人員技術水平低

實驗室未按照人員培訓程序要求進行崗前操作技能的培訓，導致在試驗中試劑取量不準確，容易導致監測數據不準確或試驗失敗。

1.2 對實驗操作規程不熟練

操作人員不熟練掌握ELISA 檢測試劑盒說明書，不能精準掌握反應時間，易出現檢測結果的不準確。

2 儀器設備方面易出現的問題

常見移液器和酶標儀不檢測校準或酶標儀讀數錯誤。ELISA 試驗取樣微量，要求取量精確、移液器和酶標儀儀器精準、計量精確，試驗結果才能準確，否則難以確保試驗結果的準確性。

3 操作過程中易出現的問題

3.1 加樣過程常出現的問題

（1）每次加不同標本時不更換槍頭，易發生交叉污染。（2）加樣時速度太快，將標本加在孔壁上部或濺出或產生氣泡。（3）為了防止操作時差對結果的影響，使用血清稀釋板先把血清稀釋好，再轉移到檢測板子中，加樣時對稀釋后的血清不吹打混勻。（4）在加酶結合物和顯色液時，由于檢測樣品過多且使用單道移液器，造成加樣間隔時間過長，使加液過程不能迅速完成。

3.2 溫育過程常出現的問題

3.2.1 溫育板上不加蓋 抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育。溫育過程在ELISA 檢測中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。溫育常采用的溫度有43 ℃、37 ℃、室溫等。37 ℃ 是實驗室中常用的溫育溫度，為避免蒸發，板上應加蓋或用塑料貼紙覆蓋板孔（FMD-3ABC 和CSFV 試劑盒）。在試驗操作過程中往往板上不加蓋。

3.2.2 反應板疊放 溫育過程中，若要求室溫溫育，則一般是指20～25 ℃。室溫溫育中經常出現將反應板疊放現象，將難以保證各板的溫度都能迅速平衡。

3.3 洗滌過程常出現的問題

3.3.1 洗滌次數不按說明書要求 洗滌目的是去除反應體系中與反應無關的成分、未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。洗滌時不按照說明書要求洗滌次數進行洗滌。

3.3.2 洗滌操作不規范 洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式，無論洗板方式如何，洗滌操作應規范，在向板孔內注液時出現氣泡殘留孔內，因洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。

3.4 顯色過程常出現的問題

顯色是 ELISA 中的最后一步溫育反應，在以HRP 作為標記酶的ELISA 試劑盒中，主要采用TMB 和OPD 兩種底物，其中以TMB 最為多見，TMB 底物顯色一般要求室溫，如果升高或者降低反應溫度均可影響檢測結果。為了保證結果的穩定性，必須固定顯色時間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點。

3.4.1 出現反應板顯色淡，靈敏度偏低的原因（1）試劑盒在運輸途中時間太長或環境溫度太高。（2）試劑盒取出未充分平衡。（3）試劑盒以前使用過，使用次數過多。（4）使用了錯誤的標記物。（5）試劑失效或不同批號的試劑混用。（6）實驗室檢測環境溫度低或恒溫箱溫度不足37 ℃，溫育時間不足。（7）樣品保存時間過久或被反復凍融過。（8）洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長，洗滌次數增加洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液。（9）移液器吸液量不足，吸頭內壁掛水太多或內壁不清潔。（10）底物作用時間不足。

3.4.2 出現反應板背景深，非特異性反應偏多的原因 （1）洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留，樣品被污染。（2）實驗室的溫度過高，培養箱溫度超過37 ℃或溫育反應時間過長。（3）不使用一次性吸頭，吸頭重復使用未洗凈或消毒不徹底。（4）稀釋用的蒸餾水被污染。（5）底物變質或不同批次的試劑混用。（6）加樣時間太長，導致實際反應時間延長。

3.4.3 出現白板，陽性對照不顯色的原因（1）顯色液變質。（2）洗滌液配制有誤。（3）忘記加酶結合物或某個底物液。（4）終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用。

4 應采取的糾正措施

4.1 人員方面

（1）實驗室應開展ELISA 試驗操作的培訓，使每位實驗操作者能夠熟練掌握檢測方法，熟悉檢測試劑盒使用說明書，避免操作的失誤。（2）實驗室應做好年度質量控制計劃，及時開展人員比對活動，提高實驗員的操作技能。（3）實驗室定期開展能力驗證計劃，及時進行有能力實驗室之間比對或參加業務上級開展的實驗室比對活動，來提高實驗室檢測水平。

4.2 儀器設備方面

（1）實驗室應嚴格按照儀器設備管理程序要求，認真按照儀器設備操作規程操作，定期做好設備的維護。（2）應按照儀器設備檢測和校準計劃，定期將計量設備移液器和酶標儀送到有資質的計量單位進行校準。（3）有條件的實驗室可采購多臺儀器設備，期間可按質量控制計劃進行儀器設備或實驗室間的儀器設備結果比對，驗證儀器設備的準確性。

4.3 試驗操作方面

（1）試劑盒在運輸途中盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫。（2）實驗前試劑盒從2～8 ℃ 冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20 min，確保所有試劑已平衡至室溫（約25 ℃）。（3）試劑盒使用前應仔細查驗，查看試劑盒從冰箱里拿出的次數，查看試劑盒是否曾在外界某個地方或極低的溫度下太長的時間。（4）為確保使用的標記物來自試劑盒和批次是特異性的，避免每次倒出的試劑下次再使用或倒回原瓶，不要過早的將標記物倒出。試劑失效或不同批號的試劑不能混用。（5）試劑盒使用后應將使用過的板條及時廢棄，以免下次重復使用，未使用過的包被板，切記勿撕開上面的封膜。（6）應保持室內溫度在20～25 ℃ 內，避免在熱源、直射光照下或通風口旁邊操作。按試劑盒規定的時間溫育，準確定時，不能過長或過短。調整恒溫箱溫度，使恒溫箱溫度保持37 ℃，避免溫度過高或過低，放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定。（7）樣品應新鮮采集，低溫保存，應避保存時間過久或被反復凍融過，血清樣品應避免溶血。（8）校正移液器，吸頭要配套，盡可能使用一次性的，裝吸頭時要緊密，保證吸頭內壁清潔，避免移液器吸液量不足或吸頭內壁掛水太多。（9）確保使用試劑盒配置的洗滌液，標明洗滌液以免誤用，每次加液前均應看清各試劑的標簽，避免洗滌次數增加、洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液。濃縮洗液配制要準確，如有結晶則應讓結晶于室溫全部溶解后再量取稀釋，充分洗滌，徹底拍干。加酶標記物后拍干用的濾紙不要反復使用，避免造成污染，注意不要漏加和忘記加酶結合物。（10）使用新鮮蒸餾水，避免稀釋用水被污染。（11）洗滌時按說明書要求的浸泡時間和洗滌次數進行洗滌，避免沖擊力太大、浸泡時間過長。合理安排試驗，如果一次試驗的樣品量過多，可采用多道移液器或多人試驗，盡可能避免加樣時間太長。（12）底物和顯色液應避光保存，底物溶液使用時應現用現配。底物在加到檢測板之前，應檢查是否變藍，如出現變質，棄去不用。（13）終止液不能作洗滌液稀釋或當底物液使用，底物顯色終止后，盡量在30 min 內進行酶標板讀值。酶標儀讀數前應檢查波長是否正確，檢驗酶標儀的校正和對準燈。