椎間盤纖維環生物學修復的研究進展

楊俊輝，姜成 綜述 黃春明，李小川，3 審校

1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524000；2.廣東醫科大學附屬高州醫院，廣東 高州 525000；3.高州市人民醫院博士后創新實踐基地，廣東高州 525200

隨著社會老齡化的發展，椎間盤退行性疾病(intervertebral disc degenaration，IVDD)的發病率也逐年遞增[1]。據統計，全世界大約有4/5的人在其一生中至少經歷過一次嚴重的下腰痛，而IVDD是導致下腰痛的主要原因之一[2]。盡管腰痛很少危及生命，但每年因腰痛所帶來的身體殘疾、醫療費用等經濟損失巨大[3]。

椎間盤由中央的髓核(nucleus pulposus，NP)和周圍包饒的纖維環(annulus fibrosus，AF)構成，與相鄰椎體、椎旁肌和韌帶等組織一起，維持脊柱靜息及運動狀態的穩定[4]。眾所周知，纖維環損傷是導致椎間盤術后療效不佳的重要因素，包括長期腰背疼痛、椎間盤退變持續加重和椎間盤突出復發等。研究表明，椎間盤切除術后突出復發或疼痛的概率為5%～25%[5]。因此，恢復纖維環結構和功能的完整性，對腰痛癥狀的緩解、降低椎間盤突出復發率等都具有重要意義。由于纖維環是一個相對封閉的無血管組織，其自我修復能力有限，外科干預往往很難達到理想的修復效果，因此探索新型纖維環生物修復療法逐漸成為研究熱點。纖維環損傷的生物學修復通常指用生物材料或生物反應調節劑，如使用基因、細胞、組織工程等，通過基因治療、細胞移植、組織工程構建等方法促進纖維環及其基質再生，恢復其生物力學特點，從而修復受損的椎間盤。為此，本文綜述了目前纖維環修復與再生治療的研究進展，以期為今后的研究方向選擇提供幫助。

1 纖維環的解剖與生理

1.1 纖維環的結構和組成 人體纖維環是一種無血管結構，由15～25個同心層組成，每層纖維環間呈60°夾角斜行排列[6]，具有較強的抗牽拉性與抗壓縮性，同時能防止髓核向外突出。其大致可分為內、外兩層，由內到外，蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量逐漸降低[7-8]?？傊?，纖維環獨特的組成和結構對于維持椎間盤的各向異性、彈性機械載荷以及維持內環境穩定至關重要。

1.2 纖維環的損傷機制 目前認為纖維環的損傷機制主要包括3個方面：長期或過高的機械負荷導致椎間盤內壓增高并使纖維環變形；異常蛋白水解酶活性增加導致纖維環細胞外基質的代謝失衡；以及纖維環營養物質的供給障礙。另外，包括細胞內損傷、氧化應激、異常細胞反應造成的損傷以及pH 值變化[9-10]等，也可誘導或加速纖維環細胞的凋亡。

1.3 纖維環損傷致椎間盤退行性病變的機制 椎間盤退變的具體機制目前尚未明確，其發生發展與年齡、遺傳、環境、損傷等多種因素相關。而纖維環受應力損傷后導致的纖維環破裂、髓核突出[11]是導致其退變的重要因素之一。在急性損傷或慢性應激的情況下，受損的纖維環發生微斷裂，使髓核從薄弱的環形裂隙處突出；同時在受損部位形成強烈的炎癥反應，導致細胞凋亡和椎間盤細胞外基質的代謝失衡，促進椎間盤退變的發生。此外，纖維環損傷后其完整性遭到破壞，從而改變了椎間盤內的靜水壓，使椎間盤生物力學性能發生改變，其強度和抗壓縮性均不同程度降低，不斷加重椎間盤的退變[12]。

2 纖維環的修復策略

2.1 纖維環縫合、封堵技術 為了恢復椎間盤的正常功能，人們做了許多關于纖維環修復策略方面的嘗試。最近，一些纖維環修復的縫合系統及植入式設備已經上市，如AnchorKnotTM和BarricaidTM系統。AnchorKnotTM系統[13]是用縫線來閉合纖維環缺損，以防止髓核進一步突出。BarricaidTM系統[14]的修復方式于2019 年獲得FDA 批準，其作為一種植入裝置，插入損傷椎間盤附近椎體以形成一個聚酯纖維網屏障。其后續隨機臨床試驗表明2 年內的癥狀再發率有所降低，但致終板改變的發生率較高[15-16]。這表明該器械的長期療效和安全性，尤其是在器械固定期間椎體和軟骨終板的變化方面，仍有待確定。傳統的纖維環的修復方式僅實現物理修復，主要是對纖維環損傷部位的縫合、修補、封堵等，并不是理想的修復策略[17]?，F有的外科治療手段已被證明只能在手術后短期內緩解癥狀和維持脊柱穩定性，長期隨訪發現大部分外科手術患者手術鄰近椎間盤會相繼出現退行性變和生物力學特性改變。目前單獨應用于纖維環損傷的生物學修復技術還未應用于臨床，但許多在大動物模型的體內實驗表明，使用生物學修復策略治療后的椎間盤能夠恢復到同健康椎間盤最大承受內壓的2/3[18]，具備較好的生物力學性能。此外，一項使用細胞移植自體骨髓間充質干細胞(MSC)治療椎間盤退化后1年的臨床進展隨訪發現，其疼痛、殘疾狀況和生活質量較外科干預患者短期改善效果更為有利[19]。各項研究都表明，利用生物學修復策略來促進纖維環以及鄰近椎間盤的再生長，較傳統修復方式更為安全有效。

2.2 纖維環修復的生物學治療 由纖維環損傷引起的椎間盤退變是非常普遍的，通過修復受損的纖維環可預防或治療IVDD。然而，由于纖維環的內源性愈合能力較差，難以依靠自我修復達到治療的目的。因此，研究椎間盤纖維環再生的生物學治療是一個亟待解決的問題。椎間盤纖維環的生物療法可以分為3大類：基于細胞移植的治療，材料學為主的組織工程治療，以及改變內源性基因表達和功能的基因治療，在近來的相關研究中展現了具有潛力的治療前景[20]。

2.2.1 細胞療法 細胞治療是通過植入、替換損傷和凋亡的細胞，促進椎間盤中的細胞再生以提高纖維環中的活細胞量[21]，是纖維環修復的理想方法。目前細胞療法最理想的種子細胞還沒有定論，可能的細胞來源包括從椎間盤提取的自體軟骨細胞、椎間盤細胞和干細胞。由于自體軟骨細胞與纖維環細胞有相似的細胞表型[22]，可用于纖維環細胞治療，但由于蛋白多糖與膠原的比例低于椎間盤細胞，可能不是細胞移植治療的最佳來源。研究發現，自體纖維環細胞可能是纖維環修復理想的細胞來源[23]，但由于臨床取材困難，而且其細胞密度較低，嚴重限制了其應用價值。間充質干細胞(MSC)在不同環境下可分化為特定細胞，作為種子細胞具有較大優勢，體內實驗表明，同種異體干細胞在纖維環和髓核的修復中均顯示了有意義的作用[24]。但這一方法目前尚處實驗階段，實現細胞的定向分化和應用產生的倫理問題仍有待解決。

2.2.2 組織工程 組織工程修復纖維環技術的基本思路是將種子細胞與纖維環修復支架共培養后植入纖維環破口，借助植入細胞的再生長使纖維環破口得到生物學修復[25]。纖維環組織工程的種子細胞主要是纖維環細胞和MSC等。目前諸多國內外學者己成功通過靜電紡絲、冷凍干燥、濕紡等技術構建多種纖維環支架。最近的研究表明，電紡角層結構和膠原凝膠復合材料能夠部分復制或模擬纖維環組織的結構[26-27]。但彈性性能缺失及穩定性是亟待解決的問題。3D生物打印支架成為解決穩定性問題的新選擇[28]，但主要缺點是當前的3D修復纖維環方法無法形成維持纖維環細胞黏附和表型的纖維形態。缺乏合適的打印材料[29]以及纖維環組織結構、功能實現的復雜性，是組織工程在纖維環修復臨床應用上所面臨的挑戰之一。此外，選擇適合的生物活性因子來模擬自然纖維環的生存環境，從而誘導種子細胞的分化和維持細胞表型[30]，創造有利于纖維環細胞修復和再生的環境是另一關鍵。有研究發現，生長分化因子(GDF)-5、結締組織生長因子(CTGF)和轉化生長因子(TGF)-β3有助于干細胞向纖維環細胞的生長分化[31-33]，相關研究雖然證實在體外實驗中纖維環支架的有效性，但缺少動物實驗證明該支架在椎間盤特殊的微環境中能否發揮功能。此外，相關研究表明，富含血小板血漿(PRP)可作為促進生物椎間盤修復的潛在治療候選者[34]，具有良好的應用前景。然而，生物活性因子的劑量、制備方法和作用機制等尚未形成共識，仍有待進一步研究。

2.2.3 基因治療 基因治療是將目的基因通過病毒或非病毒載體轉入細胞并表達特定的基因或蛋白，從而實現對疾病的治療或預防[35]。其相對長期的治療效果對治療緩慢進展的椎間盤退化具有潛在優勢。在基因治療中，靶基因的選擇和載體至關重要。在纖維環損傷的基因治療方面，目前最常用的是病毒載體，比如利用慢病毒載體轉染shRNA來抑制C/EBP同源蛋白的表達，阻止纖維環細胞的凋亡[36]。而腺相關病毒載體因其較少的免疫原性和非致病性而被廣泛應用。XI等[37]通過腺相關病毒轉染的rAAV-hVEGF165和AAV-TGF-β1共培養證明hVEGF165聯合TGF-β1可協同促進退變椎間盤纖維環細胞I型膠原蛋白的表達，能促進受損纖維環的修復。

雖然基因治療最初主要是通過病毒載體介導的，但技術進步使得包括微泡增強超聲技術、RNA 干擾、多鏈膠束和CRISPR/Cas9 等非病毒基因治療應用于椎間盤成為可能[38]。CAMBRIA 等[39]報道了在體外通過CRISPR/Cas9 基因編輯系統成功敲除了瞬變感受器電位蛋白V4(TRPV4)基因，從而抑制了纖維環損傷中的炎癥反應，有望成為治療纖維環損傷引起的慢性腰痛的新技術。另外，MASAAKI 等[40]的研究表明，mTOR信號通路參與了兔纖維環細胞的增殖和代謝周期的調節，相關調節蛋白或基因可作為基因治療的潛在靶點。非病毒基因治療可以減少病毒基因治療帶來的致突變性和病毒感染的風險，避免了病毒基因治療的許多局限性，為基因治療的應用帶來新的可能。但是，成本高昂、轉染率低和靶向性差是非病毒基因治療應用所面臨的挑戰。

3 展望

生理情況下，纖維環的自我修復能力微弱而緩慢，通過生物學修復的方法有助于恢復纖維環結構和功能的完整性，這對于緩解甚至逆轉IVDD 有重要意義。對于輕度和中度IVDD，通過細胞移植可能是一種有效的治療方法。然而，對于需要結構支持的嚴重IVDD，通過組織工程可以更好地實現多功能治療。同時，基因治療相對長期的療效在治療緩慢進展的椎間盤退化方面具有潛在的優勢。雖然目前纖維環生物學修復的相關研究已經取得了可喜的進展，但這些修復方法尚未超越臨床前動物實驗階段，同時這些技術在恢復椎間盤生物力學上的長期效能仍有待證實。此外，更好的種子細胞來源、組織工程材料的選擇、靶基因的構建以及良好的生物相容性，在保證纖維環強度的同時恢復椎間盤力學結構的完整性等關鍵難題尚未解決。如能解決這些問題，細胞移植、基因治療、纖維環組織工程構建等新方法將在椎間盤纖維環修復領域將發揮重要作用，成為椎間盤退行性疾病治療的新方向。