我國香菇雜交育種相關技術發展*

胡建平

（1．慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800；2．食用菌生物科技浙江省工程研究中心，浙江 慶元 323800）

食用菌在我國已經成為第五大農作物，其中香菇（Lentinula edodes）產量占第一。香菇栽培發源于浙江慶元，至今已經有800多年歷史[1]。同其他農作物的種子一樣，菌種的品質是其生產的重要制約因素。香菇的育種技術日趨成熟，目前主要的育種技術包括：人工選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質體融合育種、基因工程育種以及分子標記輔助育種。在眾多香菇育種方法中，雜交育種是非常重要的育種技術，因其育種目標性較好，是今后一段時間里香菇品種選育的主要手段[2]。雜交育種是一個系統性工程，包括雜交模式的選擇、親本的選擇、雜交種鑒定篩選以及交配型鑒定等。通過將香菇雜交育種及香菇技術發展進行綜述，為開展香菇雜交育種等工作提供借鑒。

1 香菇雜交育種相關概念及模式

1.1 單核體

香菇菌絲的每個細胞中有2個獨立的細胞核，通過2個細胞核的相互作用，完成香菇遺傳物質的傳遞。在雜交前首先要得到細胞中只含一個細胞核的單核菌絲。由孢子萌發而得到的單核體稱為孢子單核體，通過原生質體制備而得到的單核體為原生質體單核體。

1.2 交配型

香菇的交配型由A、B兩個交配因子控制，香菇屬于異宗結合的四極性擔子菌，即必需由2個不同交配型的菌絲細胞交配才能生育。一個香菇菌株分別含有2對不相容的交配因子（A1和A2、B1和B2），同時每個交配因子含有許多復等位基因，使得香菇自然群體的交配型非常龐大。只有A、B因子均不同時，單核體才能配對成雙核體[3]。

1.3 雜交種

將來自2個親本的單核體通過不同的技術手段進行配對可得到雙核菌株，即具有2個親本各一半遺傳物質的新菌株，即雜交種。形成雜交種的過程也稱雙核化，異宗結合擔子菌包括交互、單向、限制性3類雙核化[4]。

1.4 單-單雜交

利用不同的細胞核的單核體進行兩兩組合配對，當兩個單核體交配型符合配對規則時，會形成雙核菌株，這個過程即單-單雜交。利用單-單雜交技術取得的成果較為顯著，比如香菇新品種L934與L937的選育[5]、Cr系列的選育[6]、撫香一號的選育[7]等。

1.5 雙-單雜交

布勒現象是指1931年布勒發現的單核菌株會被雙核菌株雙核化，即單核體與雙核菌絲接觸生長時，單核體細胞核會與雙核菌絲中的一個細胞核形成新的雙核菌株的現象；香菇也具有布勒現象，利用單核菌株雙核化進行的雜交育種即雙-單雜交[8]。由于“先導核效應”，即當可親和的單核菌絲與雙核菌絲接觸生長時，雙核菌株中只有其中一個特定的核進入單核體構成新的雙核菌株[9]，因此一種雙-單雜交配對組合只形成一種核型的雜交種。同時研究表明，先導核的遷移速受B交配因子控制[10]，相同單核體與不同雙核菌株雜交形成的雜交種是同質異核體[11]。利用雙單雜交，育種家們成功選育出香菇新品種申香8 號[12]、申香 10 號[13]與 JW 系列[14]。

1.6 自交

自交包括多孢自交和單孢自交。多孢自交即同一菌株的孢子制作成合適濃度的孢子懸浮液，涂布于PDA培養皿中，萌發后各菌落生長交織起來后，形成具有拮抗線的多個小塊，分別挑取其中一小塊，轉接培養后，經拮抗等鑒定，得到雜交種，香菇新品種“申香1644”的選育就采用了多孢自交技術[15]。單孢自交則是同一菌株，通過孢子收集、單核體制備后，進行配對組合，經過鏡檢挑取雜交種的方法。

1.7 多孢雜交

多孢雜交是利用收集到的不同親本菌株的孢子，制成合適濃度混合的懸液，經過與多孢自交相同的涂布、挑取等工序得到雜交種的過程。

由于多孢雜交、多孢自交不像單孢雜交一樣能夠明確知道是由哪2個單核體配對組合而成，且關于多孢自交與多孢雜交報道的文獻也較少，對于要進一步進行遺傳學分析的育種，不建議過多涉及。因此建議利用孢子、原生質體制備等技術首先得到單核體，再進行自交或雜交，更利于后續工作的開展。

2 親本的篩選

親本的選擇至關重要，關系著雜交育種的效率和最終能否得到目標菌株。因此應根據基因型對雜交后代的性狀有較為準確的預判，再根據育種目標篩選親本[16]。然而以往在選擇親本時，更多的育種人是根據經驗與技巧進行篩選，不能較精準的預判育種結果，導致育種效率較為低下。

為此，科研工作者在親本篩選上進行了一定的研究與探索?？梢岳镁垲惙治龇ㄟx擇香菇雜交親本[17]，親本間DNA的相似值作為親緣關系的判斷標準[18]。隨機引物擴增多態性DNA（RAPD）標記[19]，簡單重復性序列間區（ISSR）標記[20]技術都可用于分析親本間的親緣關系等，并據此選擇親本。

育種家認為，親本來源地與雜交后代栽培地相同時，選育出的子代出菇率更高[21]。另外研究表明，目前我國在用的香菇菌種種質來源比較窄[22-23]，已經成為制約香菇生產的一大因素。因此在香菇育種中要注重收集野生種質資源，經過評價后，能夠利用雜交技術將更多的野生香菇基因引入主栽品種體系中。

在親本篩選方面，雖然已經開展了一些科研工作，但仍然是依據經驗者居多。如何構建系統的種質資源評價體系，同時利用先進的表型組學和基因組學技術，為雜交育種選擇更合適的親本，是目前面臨的重要挑戰，也是關系雜交育種效率和靶向性的問題。

3 單核體及其制備

3.1 孢子單核體

孢子單核體是指由孢子萌發而成的單核體。孢子單核體的制備，首先是得到親本子實體，收集其彈射出來的孢子，通過制作孢子懸浮液，涂布后，挑取單菌落，經過鏡檢鑒定最終得到單核體。由于孢子單核體經過了有性生殖過程，孢子中的遺傳物質發生過重組等，得到的單核體遺傳物質同親本具有較大差異[24]。

3.2 原生質體單核體

利用溶壁酶溶解親本的雙核菌絲細胞壁制備原生質體，再在恢復培養基中使其恢復細胞壁和生長，在原生質體恢復過程中會形成部分只具有一個細胞核的菌落，挑取并篩選這些單菌落，即得到原生質體單核體，這些單核體由于沒有經過有性生殖世代，其遺傳性狀同親本保持高度的一致[25]。

4 雜交種鑒定、篩選、種性保持

雜交育種的最終目的是能夠在眾多交配組合中選到符合育種目標的雜交種，因此還涉及雜交種的鑒定、篩選以及后續的保藏等。

雜交配對組合要求達到一定的數量，才能獲得符合預期的雜交種。然而傳統的方法是經過顯微鏡檢觀察鎖狀聯合挑取雜交種，再經過鑒定、菌絲培養和出菇試驗，最終篩選出雜交種，這樣的操作工作量大，效率不高且耗時長。

雜交種鑒定可以用拮抗試驗進行，但是拮抗反應在遺傳關系較近的菌株間分辨率不高，且易受環境及操作者經驗等因素的制約[26]，因此拮抗試驗只能作為初步判斷結果[27]。為提高判斷準確性，育種家將拮抗試驗與酯酶同工酶酶譜連用進行綜合判斷[28]?；疑P聯度分析也被用于雜交種的篩選中[29-30]，然而此分析方法要求將雜交種進行出菇試驗，根據觀察與相關結果進行分析，需要投入大量的資源和時間。

研究表明，在分子水平通過雜交種DNA多態分析，聚類分析等手段是可以有效提高雜交育種效率的[29]。RAPD分析因其靈敏度高、可重復性強、易操作而被引入到雜交育種分析中[31]。之后內轉錄間隔區（ITS）序列分析[32]、ISSR[33]、信使 RNA（mRNA）差異顯示技術[34]等相繼用于香菇雜交育種中。

對于雜交種篩選出來后如何進行種性保持等方面的研究較少，黃秀治[35]研究了雜交種多孢自交、雜交種組織分離、親本單核體重新配對、雜交種自交、原始菌株傳代等對雜交種種性保持的影響，認為原始菌株傳代、雜交種組織分離、雜交種自交可以得到穩定的菌株，同時自交還能提高雜交優勢。

5 交配型及其鑒定

交配型的鑒定與研究香菇雜交育種密切相關[36]，只有符合交配規則的交配型單核體組合才能配對形成雜交種。香菇作為異宗結合的四極性擔子菌，每個菌株子實體能夠至少形成4種交配型[37]，而且在香菇這個群體中，不同菌株有著許多的交配因子復等位基因，據估算香菇群體中存在121個A因子和151個B因子[38]。

香菇交配型基因有許多應用：1）遺傳研究，估測自然群體中香菇的不親合因子數；2）種質資源評價與種質庫建設；3）菌種鑒定，以原生質體單核體的交配型作為標準，采用交配型分子標記進行菌種鑒定[36，39]；4）菌種退化指標，以交配型基因的復等位性和多態性為依據，以待測菌株的原生質體單核體為材料，香菇單核體交配型的異常，可以作為菌種退化的一個遺傳指標[40]。

在雜交配對組合之前，最好將親本單核體按照交配型進行分類，從而提高雜交組合配對成功率。交配型的檢測方法主要有兩兩配對法、標準菌株法及分子標記法。兩兩配對法對于A、B因子均相同和均不同的配對組合，通過觀察鎖狀聯合結構可以可靠地進行判斷；而對于A相同而B不同的配對組合和B相同而A不同的組合，則需要通過培養基轉換法（OWE-SOJ）加以鑒定[41]。分子標記法是基于基因序列分析進行交配型鑒定，可以基于單核苷酸多態性SNP分型[37]、ISSR分型等。

交配型因子存在著偏分離的現象，即一個菌株的孢子交配型并不趨于1∶1∶1∶1，引起偏分離的原因有很多，可能是致死純合基因[42]、親本來源[43]、親本細胞質遺傳影響[44]、雜交過程中重組與突變[45]等。同樣雙核菌株制備的原生質體單核體交配型比例通常也不是趨于1∶1。該比例與核的再生能力和生長速度有關[46-47]，偏分離的主要影響因子是B因子，它控制著核的存活率[45]。研究表明，栽培菌株交配型偏分離大于野生菌株[48]。

6 雜交技術

在雜交技術上，較為傳統與常見的是先檢測單核體極性，再進行配對組合；另外一種則是采用單核體菌落形態觀察，來選擇配對組合[35]。規范化的雜交操作有利于提高雜交育種效率以及后續的遺傳分析，但目前關于雜交工藝的研究與闡述較少，因此建議對雜交工藝進行研究，形成規范化的標準，便于今后雜交育種工作的開展與交流。

7 展望

雜交育種是現行和今后一段時間內香菇育種的主要方式，為提高雜交育種的效率和目標性，應該從以下幾個方面加以深入研究。

7.1 單核菌絲保存技術

單核體在保藏過程中遺傳性狀較容易發生改變，研究發現經過1年保存后，單核體間生長差異等變小[49]。單核體能否長期保存將制約雜交育種，開發適宜長期保藏單核體的技術，如單核體超低溫液氮保存等，已迫在眉睫。同時還可以研究將單核體雙核化，在使用時能快速得到該單核體的技術。

7.2 分子標記快速精準育種

現有的利用DNA多態性開發的分子標記技術，依據于某個群體的多態性，僅適用于該群體的區分與鑒定。通過分子標記等技術的開發與利用，精準育種已取得一定成效，但是由于遺傳學基礎研究較為滯后，所開發的分子標記大部分不是通用的，而僅僅可作為一個群體（比如幾個或者幾十個菌株間）分離鑒定的依據。靶向測序基因型檢測（GBTS）等有望較好的彌補以往分子標記不通用的問題。同時可以結合基因測序等現代技術，定位更多基因，通過基因編輯技術，創制更多的優良育種材料，再利用雜交育種，提高育種效率和目的性。

7.3 高通量表型鑒定

雜交種的鑒定與出菇試驗耗時長仍然是影響雜交育種效率的最主要因素。開發高通量表型鑒定技術，能提高出菇試驗中考種工作的效率。

7.4 種質資源收集與評價

育種離不開大量優質的種質資源，收集全國乃至全世界的香菇種質資源，并對其進行細致的評價分析，從而為后續雜交育種的開展提供豐富的親本材料，也是我們要抓緊開展的工作。