WSTF過表達的乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲、遷移能力變化及其機制

張順禮，王雅琪，胡繼衛，馬杰，谷崢，王宇，蔣楠

唐山市人民醫院乳腺外科，河北唐山 063000

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一，在女性惡性腫瘤中的病死率位居第二［1］。隨著醫療技術的發展，乳腺癌患者手術治療后的5年生存率顯著提高，但是術后腫瘤復發和轉移是乳腺癌治療中的一個重大難題［2］。手術、放療和化療是目前臨床上乳腺癌的主要治療方式，但是化療藥物的耐藥性導致治療效果大大降低［3］。因此，了解影響乳腺癌細胞惡性生物學行為的相關機制，對于抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲具有重要意義。威廉姆斯綜合征轉錄因子（WSTF）是一種多面蛋白，屬于WAL/BAZ/WAC蛋白家族，該家族包含一個與植物同源結構域（PHD結構域）相鄰的C-末端溴代半乳糖基序，與RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ基因調控、維生素D代謝、染色質裝配和DNA修復等多種細胞功能有關，并參與基因轉錄的調控［4-5］。近期研究發現，WSTF可能通過形成不同的染色質重塑復合物而發揮不同的作用［6］。此外，WSTF具有WAC結構域的固有酪氨酸激酶活性和額外的N-末端區域，其在DNA損傷反應中起關鍵作用，因此可能決定DNA損傷后的細胞命運［7］。近年來研究顯示，包括WSTF在內的溴代多糖蛋白與腫瘤發生相關［8］，但目前WSTF在乳腺癌發生發展中的作用及其機制尚未可知。為此，2021年6月—2022年6月我們進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料細胞：乳腺癌MCF-7細胞株購自成都匹拓生物科技有限公司。主要試劑：RPMI 1640培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、RNA反轉錄試劑盒均購自南京建成生物有限公司；慢病毒表達載體pLVXPRDX4、慢病毒干擾載體pLVX-shPRDX4、空載體pLVX-NC均購自上海捷瑞生物公司；qCCK-8、PCR試劑盒均購自上海優寧維生物有限公司，凋亡檢測試劑盒購自美國Sun-Shine公司，RNA提取試劑盒購自武漢三鷹有限公司；WSTF、白細胞介素6（IL-6）、信號傳導子及轉錄激活子3（STAT3）、β-actin蛋白抗體及二抗均購自美國Abcam公司。主要儀器：倒置顯微鏡、流式細胞儀購自意大利賽默飛公司；Bio-Rad微孔板閱讀器、LAS 4000成像系統均購自美國GE Healthcare公司。

1.2 細胞分組及轉染從液氮罐中取出乳腺癌MCF-7細胞株進行復蘇，將復蘇后的細胞置于RP?MI 1640培養基中，采用細胞培養皿進行分裝，置于37℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養24 h，細胞融合率達70%后更換培養基，加入胰蛋白酶消化。將MCF-7細胞分為對照組、空載組、WSTF低表達組和WSTF高表達組。將空載組、WSTF低表達組和WSTF高表達組細胞接種于小皿中，37℃、5%CO2恒溫環境中培養24 h，分別轉染空載體pLVX-NC、慢病毒干擾載體pLVX-shPRDX4、慢病毒表達載體pLVX-PRDX4 10 μL，48 h后加入含5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養基繼續培養，以篩選穩轉細胞株；對照組常規培養，不進行處理。

1.3 細胞生物學行為觀察

1.3.1 細胞增殖能力采用CCK-8法。取各組細胞，加入胰蛋白酶1 mL，輕微吹打2 min，使細胞完全懸浮。將懸浮的細胞轉移到1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，棄上清；加入RPMI 1640培養基1 mL，充分懸浮細胞。取一塊新的96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，培養箱中培養24 h后棄去培養基，加入新的RPMI 1640培養基培養24 h，棄去培養基，加入培養液100 μL和CCK-8溶液10 μL，培養3 h。每組設置6個復孔。Bio-Rad微孔板閱讀器讀取450 nm處的吸光度（OD）值，計算細胞存活率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 細胞凋亡能力采用流式細胞術。將各組細胞用PBS吹洗兩次，1×結合緩沖液懸浮細胞，調整密度為1×106/mL，加入Annexin V-FITC 5 μL，黑暗中室溫孵育15 min；加入PI 10 μL，4℃避光孵育5 min，上流式細胞儀計算細胞凋亡率。實驗重復6次，取平均值。

1.3.3 細胞侵襲能力采用改良Matrigel Boyden小室實驗。在有基質膠的濾膜上接種各組細胞，制備密度為5×105/mL的細胞懸液，配置10%的FBS作為趨化劑，將趨化劑放在濾膜下倉室。將濾膜置于培養箱中培養24 h，對濾膜染色。在每個濾膜上隨機選擇5個視野，計數每個視野的細胞數即為侵襲細胞數。實驗重復6次，取平均值。

1.3.4 細胞遷移能力采用劃痕實驗。將各組細胞制備5×105/mL的細胞懸液，接種于6孔板內，置于培養箱中培養48 h。劃痕實驗時將吸頭垂直孔壁作一劃痕，加入無血清培養基。劃痕完成后培養48 h，使用EVOS M7000倒置顯微鏡觀察，計算細胞劃痕愈合率。

1.4 細胞中WSTF、IL-6和STAT3 mRNA檢測采用qRT-PCR法。取各組細胞，應用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，反轉錄生成cDNA。按照PCR試劑盒說明書配置反應體系，進行PCR反應，各基因引物序列見表1。PCR反應體系：引物2.25 μL，cDNA 3.0 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL，去酶水7.5 μL。PCR反應條件：94℃、12 min，96℃、12 s，62℃、25 s，72℃、40 s；共35個循環。采用2－ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 WSTF、IL-6、STAT3及內參GAPDH引物序列

1.5 細胞中WSTF、IL-6和STAT3蛋白檢測采用Western blotting法。取各組細胞，配置蛋白酶K溶液（PBS 1 mL加入蛋白酶K 100 μL），棄去培養皿中的培養液；加入蛋白酶K溶液1 mL，4℃條件下3 000 r/min離心20 min，用加樣槍將上清轉移至

1.5 mL EP管中。經SDS-PAGE電泳分離、轉膜和封閉，加入WSTF、IL-6、STAT3和內參β-actin一抗（稀釋比例均為1∶5 000），4℃條件下孵育12 h，孵育后的條帶清洗3次；加入二抗（稀釋比例均為1∶1 000），室溫條件下孵育2 h。LAS 4000成像并觀察結果，計算蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法采用SPSS22.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk法正態性檢驗，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率、細胞凋亡率、劃痕愈合率及細胞侵襲數比較見表2及OSID碼圖1。

表2 各組細胞存活率、細胞凋亡率、劃痕愈合率及細胞侵襲數比較（xˉ±s）

2.2 各組細胞WSTF、IL-6和STAT3 mRNA相對表達量比較見表3。

表3 各組細胞WSTF、IL-6和STAT3 mRNA相對表達量比較（xˉ±s）

2.3 各組細胞WSTF、IL-6和STAT3蛋白相對表達量比較與對照組和空載組比較，WSTF低表達組WSTF、IL-6和STAT3蛋白相對表達量均降低，WSTF高表達組均升高（P均<0.05）。見表4、OSID碼圖2。

表4 各組細胞WSTF、IL-6和STAT3蛋白相對表達量比較（xˉ±s）

3 討論

盡管手術治療顯著延長了乳腺癌患者的生存時間，但晚期患者的預后仍然不理想［9］。由于致癌/抑癌基因的多樣性和組織類型特異性，許多致癌/抑癌蛋白在乳腺癌中的特定調節功能尚未完全闡明［10］。WSTF是一種由1 425個氨基酸組成的蛋白質，其功能目前尚不明了［11］。WSTF分子中包含一個PHD型鋅指基序和一個溴代半乳糖，通常在轉錄調節器中發現，這表明WSTF可能作為轉錄因子而發揮作用［12］。此外，WSTF通過促進DNA損傷后的細胞凋亡來調節DNA損傷反應，因此在提高腫瘤細胞對放化療的敏感性方面具有潛在作用［13］。

目前有研究利用公開的惡性腫瘤mRNA表達譜數據結合TCGA數據分析，確定了WSTF與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關［14］。研究顯示，在乳腺癌MCF-7細胞中WSTF表達顯著高于正常細胞，提示WSTF可能是乳腺癌的一種致癌基因［15］。本研究結果顯示，WSTF高表達組細胞存活率、劃痕愈合率、侵襲細胞數均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，提示WSTF過表達可抑制乳腺癌MCF-7細胞凋亡，并促進其增殖、遷移和侵襲水平；這說明WSTF過表達加速了腫瘤細胞的生長和轉移，表明WSTF作為一種癌蛋白，通過促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲而發揮作用。同時本研究結果發現，WSTF低表達組細胞存活率、劃痕愈合率、侵襲細胞數均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示沉默WSTF表達可促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，并抑制其增殖、遷移和侵襲，對于臨床乳腺癌的分子靶向治療具有一定的參考價值。

上皮—間質轉化（EMT）是上皮細胞失去細胞極性，細胞與細胞之間黏附而成為間充質細胞的過程。間充質細胞具有遷移和侵襲特性，EMT對于乳腺癌進展中的轉移啟動至關重要［16］。目前研究顯示，WSTF過表達可引起E-cadherin表達降低，而Ecadherin是EMT的標志，在轉移性腫瘤中經常丟失［17］。研究顯示，PI3K/AKT和IL-6/STAT3等致癌信號通路可激活EMT，在腫瘤的發生和侵襲過程具有重要作用［18］。IL-6/STAT3信號通路已經被證實參與不同因子誘導的EMT［19］。MENG等［14］在對肺癌細胞的研究中發現，WSTF能通過激活IL-6/STAT3信號通路而促進EMT，從而加速肺癌細胞的侵襲和增殖。本研究結果顯示，WSTF低表達組IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表達均顯著降低，而WSTF高表達組均顯著升高，提示WSTF可能通過調控IL-6/STAT3信號通路而影響乳腺癌細胞的EMT過程，參與對乳腺癌細胞惡性生物學行為的調控。

綜上所述，WSTF過表達可抑制乳腺癌細胞凋亡，并促進其增殖、遷移和侵襲，其機制可能與激活IL-6/STAT3信號通路有關，而沉默WSTF表達則具有相反的作用，為乳腺癌的靶向治療提供了新的參考依據。