鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素效價含量方法學驗證

章瑛,楊毅生，張春華，姚閩

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

大多數(shù)抗生素是微生物的次級代謝產(chǎn)物，同時抗生素本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，每種抗生素大多是幾種相似組分的混合物，加之抗生素的不穩(wěn)定，產(chǎn)品中混雜著分解產(chǎn)物、異構(gòu)物等。所以給抗生素藥品分析檢定工作帶來很大困難。而微生物檢定法是以抗菌活性為指標來衡量抗生素中有效成分的效力的一種方法。

本研究以管碟法建立鹽酸萬古霉素口服液中鹽酸萬古霉素的效價含量測定方法［1-4］，并按《中國藥典》2020 年版四部通則1200 生物活性測定方法、《抗生素微生物檢定法及其標準操作》及《藥品微生物檢驗手冊》對建立的方法予以驗證［5-6］。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

ZY-300 Ⅳ抑菌圈測定儀、MS205DU 電子天平、ZY-300G 牛津放量器、PYX-DHS600×600×750 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器。

1.2 試藥與菌種

萬古霉素標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130360-201302，含量：每毫克相當于1 066 萬古霉素單位）；鹽酸萬古霉素口服液（批號：IP013-2008002、IP013-2009001、IP013-2009002，規(guī)格：50 mg/mL）；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅷ號（北京三藥科技開發(fā)公司，批號：200418；北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：210220；北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，批號：20210811，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號：20201205）；菌種：枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，來源于中國食品藥品檢定研究院。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 菌懸液、緩沖液及雙碟制備

2.1.1 菌懸液制備取枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中（36 ℃培養(yǎng)7 d），用革蘭染色法涂片鏡檢，有芽孢在85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65 ℃加熱30 min，備用。

2.1.2 緩沖液的制備磷酸緩沖液（pH6.0）：取磷酸氫二鉀2 g 與磷酸二氫鉀8 g，加水適量溶解，用水稀釋至1 000 mL，搖勻，在115 ℃滅菌30 min，即得。

2.1.3 雙碟制備取直徑約90 mm，高16～17 mm 的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基（編號：Ⅷ）20 mL，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺面上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至60 ℃，加入試驗菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5 mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層，放置水平臺面上冷卻凝固。在每一雙碟中以等距離均勻放置牛津杯4個，用陶瓦圓蓋覆蓋，備用。

2.2 標準品和供試品溶液的制備

2.2.1 標準品儲備溶液的制備精密稱取萬古霉素標準品用滅菌水制成每1 mL 含1 000 萬古霉素單位的溶液，作為標準品儲備溶液。精密量取儲備溶液適量，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成100 U/mL 溶液。再將100 U/mL 的標準溶液，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成高低劑量溶液，濃度分別為10 U/mL（S1）、5 U/mL（S2）的溶液。

2.2.2 供試品儲備溶液的制備取一份鹽酸萬古霉素口服溶液樣品（1 瓶鹽酸萬古霉素粉劑+1 瓶稀釋劑），先握住鹽酸萬古霉素粉劑瓶的頸部，在硬表面上拍打底部邊緣以松開粉末，然后從瓶子上取下瓶蓋，輕敲密封墊襯套的頂部，以松開可能黏附在襯套上的所有粉末，再緩慢地剝離內(nèi)襯密封墊，取一瓶稀釋劑，搖動幾秒，打開稀釋瓶，將倒入約一半的溶液到鹽酸萬古霉素粉劑瓶中，蓋上蓋子并垂直搖動大約45 s，然后將剩余的稀釋劑加入鹽酸萬古霉素粉劑瓶中，蓋上蓋子并搖動大約30 s，即得50 mg/mL的溶液。精密量取2 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得1 000 U/mL 的供試品儲備溶液。精密量取儲備溶液適量，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成100 U/mL 溶液。再將100 U/mL 的標準溶液，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成高低劑量溶液，濃度分別為10 U/mL（T1）、5 U/mL（T2）的溶液。

2.3 專屬性

用樣品中的稀釋劑代抗生素進行試驗，未出現(xiàn)抑菌圈。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸萬古霉素專屬性圖

2.4 線性

用上述100 U/mL 的標準品溶液，以5 U/mL 為中心濃度（Co），劑距為1∶0.8，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋成濃度為2.00、2.56、3.20、4.00、6.25、7.81、9.76、12.20、15.25 U/mL 的系列溶液，按照抗生素生物檢定法第一法管碟法（一劑量法）進行線性測定，每一個濃度為一組，每組4 個雙碟，在每一雙碟的加菌培養(yǎng)基上置6 枚牛津杯，間隔的3 枚內(nèi)加入標準品的某一特定濃度Ck，另3 枚內(nèi)加入標準品的中心濃度Co。經(jīng)培養(yǎng)16 h 后，使用抑菌圈測定儀測定各個抑菌圈的直徑。分別求得每組3 個雙碟中心濃度Co所致的抑菌圈直徑平均值及C1-C9所致抑菌圈直徑的平均值（Ck=1-9）。令fk=-，分別計算fk值，則8 組雙碟可得出f1-9 的9 個反應(yīng)參數(shù)。以fk值為縱坐標，以相應(yīng)的標準品濃度對數(shù)為橫坐標，得出回歸直線方程式y(tǒng)=6.614 1x-4.560 1，r=0.999 6，在2.00～15.25 U/mL 的萬古霉素濃度范圍內(nèi)，fk（mm）與濃度對數(shù)lgC 線性關(guān)系良好。

2.5 精密度

取鹽酸萬古霉素口服液（批號：IP013-2009001）樣品測定6 次。標準品溶液和供試品溶液高低濃度劑量同“2.2.2 供試品溶液制備”，分別為10 U/mL、5 U/mL。結(jié)果平均含量為標示量的104.0%，相對標準偏差（RSD）為2.49%。見表1。

表1 重復(fù)性試驗

2.6 準確度（回收率%）

制備9 份1 000 U/mL 的供試品溶液，從標準品儲備溶液和供試品溶液中精密量取4 mL、5 mL、6 mL，分別置100 mL 量瓶中，加磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋至刻度，搖勻，即得80 U/mL、100 U/mL、120 U/mL 的溶液各三份。按《中國藥典》2020 年版四部生物檢定法第一法管碟法（二劑量法）測定相應(yīng)的含量。分別測定3 次。結(jié)果回收率均在90.0%～110.0%范圍內(nèi)，平均回收率為99.5%。見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果

2.7 適用性

因本品種對培養(yǎng)基和緩沖液的pH 值較穩(wěn)定，方法較成熟，故只對不同來源培養(yǎng)基及溶液穩(wěn)定性進行驗證。采用4 個廠家的培養(yǎng)基進行驗證，結(jié)果RSD為0.75%，不同品牌培養(yǎng)基對結(jié)果影響較小。見表3。選一批樣品處理后，冰箱冷藏放置1 d、4 d、14 d，分別測定結(jié)果，偏差為0.72%，溶液穩(wěn)定性良好。見表4。

表3 不同廠家培養(yǎng)基測定結(jié)果

表4 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 討論

抗生素微生物檢定法分為稀釋法和濁度法兩種方法。其中，管碟法為國際通用方法，國內(nèi)外藥典均收載了此法。此法是根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系，通過比較標準品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。但由于操作步驟及影響因素較多，需要從每個環(huán)節(jié)嚴格控制實驗條件，才能使結(jié)果準確可靠［7-11］。在此次試驗中總結(jié)了如下影響因素。

3.1 前期因素

（1）試驗實驗室應(yīng)注意防止抗生素及微生物的污染，其由樣品處理的試驗間和制備雙碟的半無菌間兩部分組成。半無菌間需用紫外線燈達到空氣消毒，時間30 min 以上為宜。（2）雙碟和牛津杯的選擇盡量使用同一生產(chǎn)企業(yè)且同一批次。碟子大小不均，底部不平，會造成培養(yǎng)基厚薄不一，導(dǎo)致抑菌圈不圓，大小差異大，直接影響實驗結(jié)果的準確性。牛津杯內(nèi)徑不一和重量差異大，形成的抑菌圈大小差異較大，在培養(yǎng)基平面上下陷的深度不一致，也可使溶液擴散不均勻。雙碟和鋼管使用前應(yīng)先用專用洗液進行浸泡以后再用水沖洗，瀝干，置150～160 ℃干熱滅菌2 h 備用。（3）培養(yǎng)箱選擇隔水式恒溫培養(yǎng)箱為宜，隔板上備有帶孔的玻璃板并墊平。最主要使用之前要測定水平度，使雙碟放入培養(yǎng)時不會由于平面不平而鋼管里液體流出導(dǎo)致破圈或不成圈現(xiàn)象。（4）抑菌圈測定儀的技術(shù)指標應(yīng)符合抑菌圈測量儀檢定規(guī)程的要求，尤其是抑菌圈測定的準確度及精密度的要求，檢驗合格方能確保試驗結(jié)果的準確可靠。

3.2 試驗過程中的因素

（1）鹽酸萬古霉素具有吸濕性，在稱取萬古霉素標準品的時候容易吸濕，故天平室的濕度要控制好并且稱取時要快速，否則數(shù)據(jù)不準確而導(dǎo)致實驗得出的效價值有偏差。（2）試驗菌的敏感度，特別要防止染菌，制備菌層時含菌濃度要適宜。在雙碟倒入底層和鋪菌層時一定要鋪平，尤其是菌層，否則影響培養(yǎng)基的厚度H。H 與管中心到抑菌圈邊緣距離r 相互影響：H 增大，r 縮小；H 減小，r 增大。還有在制備菌層時，培養(yǎng)基溫度不宜過高或者溫度正常但受熱時間太長，可能會使試驗菌部分被殺死或全部被殺死，從而使抑菌圈破裂或甚至無圈。故最好培養(yǎng)基加熱融化后，置恒溫水箱內(nèi)一段時間使培養(yǎng)基均勻降溫平衡后，加入試驗菌。本試驗使用的實驗菌株為枯草芽孢桿菌，芽孢懸液對溫度抵抗力強，可提高培養(yǎng)基溫度到65 ℃，更利于攤布雙碟，如溫度過低，極易凝固，而導(dǎo)致菌層不平。（3）滴加溶液時候容易濺出落在瓊脂培養(yǎng)基表面上或者鋼管內(nèi)有氣泡。故滴加溶液時距離管口不要太高，適當調(diào)節(jié)，如有溶液濺出可以預(yù)先備好消毒小濾紙片輕輕吸去，這樣培養(yǎng)后不會影響破圈。另外還需注意滴加溶液的順序和時間，溶液的高低濃度按照SH-TH-SL-TL 的順序進行滴加，每個雙碟用時控制在1 min 內(nèi)，避免抗生素在培養(yǎng)基內(nèi)的擴散產(chǎn)生差異，降低碟間和劑間的差異，引起可信限率偏大，誤差增大。（4）雙碟疊放不宜超過3 個，保證雙碟的溫度一致，使試驗菌生產(chǎn)速度一致，避免造成抑菌圈變小或者不圓整，減小試驗誤差。

本實驗中可能還有未涉及的因素，但各因素往往不是孤立的而是相互聯(lián)系、相互作用和相互影響的。所以在操作過程中，嚴格按照操作規(guī)范，謹慎小心操作，減少外界與人為因素引起的誤差，使測定結(jié)果與真實值更為接近，提高實驗的準確性。

4 結(jié)論

鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素的效價含量測定用的管碟法（二劑量法），該方法抑菌圈直徑與萬古霉素濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，專屬性、精密度、準確度和適用性均滿足實驗要求，適合用于鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素的效價含量測定。