基于活性成分含量測定江西德興覆盆子采收期和種植條件研究

張曉云，付彩群

1.九江市檢驗檢測認證中心，江西 九江 332000；2.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330000

覆盆子收載于《中國藥典》2020 年版，為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥未成熟果實。具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目之功效，主要用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花［1］。目前藥理學研究和臨床使用證實覆盆子活性成分能直接作用于下丘腦-垂體 -性腺軸系統(tǒng)，治療男性生殖功能疾病。其作用原理可能是通過抗氧化、抗衰老、維持機體活力、調(diào)節(jié)免疫力、抵抗炎癥、調(diào)節(jié)微量元素等方面改善男性生殖功能［2-9］。2020 年版《中國藥典》覆盆子含量檢測指標成分為鞣花酸和山柰酚-3-0-蕓香糖苷。目前的科學研究已證實覆盆子主要活性物質(zhì)有多糖類、黃酮類、皂苷類和生物堿等，張?zhí)裉瘢?0］研究表明覆盆子黃酮類活性物質(zhì)中分離得到主要化合物椴樹苷具有顯著的抗腫瘤和抗炎活性。本研究建立了高效液相色譜法檢測覆盆子中椴樹苷的含量，并利用檢測活性成分椴樹苷的含量高低，來優(yōu)選德興覆盆子的最佳采收期和生長條件，能夠更有效地提升覆盆子的品質(zhì)，確保臨床用藥療效［11-12］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 有限公司，2695 四元泵，2489 紫外檢測器，Empower 色譜工作站）；BP211D（Sartorius 公司）電子天平；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試劑

椴樹苷對照品（美國BePure 公司，產(chǎn)品批號為B0003436，純度98.1%）；乙腈（色譜純），磷酸（國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純），其他試劑均為分析純；實驗用水均為去離子水。

1.3 藥材

12 批次采摘時間和不同生長條件的樣品，自采于德興覆盆子GAP 基地內(nèi)，8 批次不同來源的覆盆子樣品采購于各藥材市場，經(jīng)九江市檢驗檢測認證中心副主任中藥師盛曉靜鑒定為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果實。具體產(chǎn)地及批次見表1。

表1 覆盆子藥材產(chǎn)地及批號

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取椴樹苷對照品16.51 mg 于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得椴樹苷濃度為0.323 9 mg/mL 的對照品母液。

2.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取編號為S3（過三號篩）的覆盆子粉末1.0 g，置回流瓶中，再精密加入25 mL 70%乙醇，稱定重量，置水浴鍋上加熱回流1 h，放冷，再用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.3.1 吸收波長以70% 乙醇為參比溶液，在200～500 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果椴樹苷在208 nm、268 nm、315 nm 處有最大吸收，因208 nm波長處較接近末端吸收，在268 nm 波長處吸收值比315 nm 波長處低，因此選用椴樹苷的檢測波長為315 nm。紫外吸收光譜圖，見圖1。

圖1 椴樹苷紫外吸收光譜圖

2.3.2 色譜分析條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：315 nm；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（29∶71）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；理論塔板數(shù)以椴樹苷峰計應(yīng)不小于4 000。對照品和供試品色譜圖見圖2。

圖2 HPLC色譜圖：A.椴樹苷對照品；B.覆盆子供試品

2.4 線性關(guān)系考察

將椴樹苷對照品母液，依次稀釋成濃度為10.123 μg/mL，20.245 μg/mL，40.491 μg/mL，80.982 μg/mL，129.570 μg/mL，161.96 μg/mL 系列含量，分別進樣10 μL，椴樹苷進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果表明椴樹苷對照品的進樣質(zhì)量在0.101～1.620 μg 范圍內(nèi)與峰面積存在著良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=24 154.6X+30 420.73；r=0.999 9。

2.5 精密度試驗

取同一對照品溶液先后進樣五次，每次10 μL，記錄峰面積結(jié)果，計算椴樹苷的峰面積RSD為0.3%，結(jié)果表明儀器具備良好的精密度。

2.6 重復性試驗

精密稱取編號為S3 的覆盆子樣本粉末共6 份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件測定，椴樹苷含量RSD 為1.91 %，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取編號為S3 覆盆子同一供試品溶液，放置在室溫狀態(tài)下，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 內(nèi)各進樣1 次，計算7 次試驗測得的椴樹苷峰面積和保留時間RSD 值。結(jié)果顯示峰面積RSD 為1.8%，保留時間的RSD 為0.6%，說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加標回收率試驗

精密稱取編號為S3 的覆盆子粉末（已知含量為0.4678 mg/g）0.5 g，共稱取6 份，分別精密加入椴樹苷對照品工作液（將對照品母液稀釋成64.78 μg/mL）5 mL，再分別精密加入70%乙醇溶液20 mL，按“2.2”項下自“稱定重量”起同法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測，計算加樣后的平均回收率為98.47%，RSD 為0.89%，結(jié)果表明該實驗方法穩(wěn)定可靠。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 覆盆子中椴樹苷的加樣回收率（n=6）

2.9 樣本測定結(jié)果

分別精密稱取表1 中的覆盆子樣本按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測，記錄峰面積，并計算椴樹苷含量，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地及采收條件樣品中椴樹苷的含量（n=2） %

3 討論

選取供試品溶液制備方法是比較了加熱回流法和超聲提取法，加熱回流法中椴樹苷提出量明顯較超聲法為高。在明確了加熱回流法后，又比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、無水乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇八種提取溶液，以70%乙醇對椴樹苷溶解度最優(yōu)。在上述提取方式和提取溶劑已經(jīng)確定的情況下，考察了不同溶液容量（15 mL、25 mL、50 mL）的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液體積增加有利于成分溶出，但超過25 mL 后溶出量增加不顯著，從節(jié)約試劑的角度選擇了25 mL 溶液體積。最后考察了提取時限（15 min，30 min，60 min，90 min）對椴樹苷提取效率的影響，結(jié)果證實，以70%乙醇25 mL，回流提取1 h 覆盆子中椴樹苷可基本提取完全。

在流動相選擇中，比較了乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液，結(jié)果顯示流動相采用乙腈-0.1%磷酸溶液不僅柱效高而且分離度好，分析時間短，從而選定乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。在上述色譜條件下比較了Agilent、Waters、Agela 三種C18 色譜柱，三種色譜柱都能較好分離，說明該方法適用性好。椴樹苷作為覆盆子中的功效性成分含量高且具有一定專屬性，可用于覆盆子質(zhì)量控制。

根據(jù)分析檢測結(jié)果（表3）可發(fā)現(xiàn)，德興覆盆子青果的椴樹苷含量明顯高于黃果，表明采收期是影響藥材品質(zhì)的關(guān)鍵因素，故要掌握好覆盆子的采收期，最佳時間為4 月底5 月初，但具體時間應(yīng)根據(jù)當年的氣候條件有所調(diào)整。背陰條件下栽培的覆盆子青果中椴樹苷含量略高于向陽條件下覆盆子青果，兩者差異相對較小，應(yīng)結(jié)合其他活性成分和經(jīng)濟效益選擇種植條件［13］。同時檢測了5 批次浙江產(chǎn)的覆盆子樣品，結(jié)果顯示5 批次椴樹苷含量平均值為0.051 0%，與江西產(chǎn)的9 批次覆盆子青果平均值0.049 7%差異不明顯。