野生白肉靈芝固體培養特性、馴化栽培及活性成分分析*

牛開陽，李娥賢，何 俊，，李樹紅，蘇錫鈞，羅宗龍**

（1.大理大學 農學與生物科學學院，云南 大理 671003；2.云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223）

靈芝屬（Ganoderma） 隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 靈芝科 （Ganodermataceae）[1]。靈芝屬真菌在全球分布廣泛，是一類重要的木腐真菌，具有維持森林生態系統物質循環和能量流動的作用[2-4]。此外，靈芝還是最早被利用，文化最悠久的食（藥）用菌之一[5]。現代研究表明，靈芝含有多糖類、三萜類、甾醇類、微量元素、脂肪酸等多種生物活性物質；其中，靈芝多糖與三萜被認為是靈芝中主要的功能成分[6]。大量研究證實靈芝具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、鎮靜安神、抗心肌缺血、調節血脂、抗病毒和改善睡眠等藥理作用[7-10]。

20世紀50年代，中國科學院微生物研究所首次成功栽培靈芝，之后靈芝在我國逐步實現廣泛栽培，并迅速發展成為以生產靈芝孢子粉為主的重要產業[11]。至今，靈芝在我國已有60多年的人工栽培歷史，隨著栽培技術的不斷發展，規模越來越大，出現了栽培品種、技術、模式和原料的多樣化[12]。截至2022年2月，獲得審定的靈芝品種有26個，其中通過國家級審定的有4個，省級審定的有22個。隨著人們生活水平的日益提高，對靈芝產品的需求不斷提升，野生靈芝資源難以滿足當前市場需求。對野生靈芝資源進行合理開發利用，既能保護野生資源，又有助于促進靈芝產業的健康可持續發展。目前，我國以赤芝（Ganaderma lingzhi)和紫芝（Ganoderma sinense）為主要原料生產的養生保健產品超過500種，藥品有100多種，中藥化妝產品12種[13-14]。

白肉靈芝（Ganoderma leucocontextum） 于2014年被廣東省科學院微生物研究所科研人員采集并命名，隨后在拉薩國家農業科技示范園區首次成功馴化栽培[15-16]。野生白肉靈芝主要廣泛分布于中國西南高海拔地區闊葉林[17]。由于其菌肉潔白，多糖和萜類等活性成分含量較高，被視為高品質的靈芝品種，產品價格往往比普通靈芝高數倍[18]。目前對白肉靈芝種質資源的研究主要集中在西藏地區，而不同地區靈芝生長特性及子實體活性成分存在較大差異[19-24]。為明確云南省野生白肉靈芝資源特性，發掘栽培性狀好、活性成分高的靈芝菌株，以采自云南省昆明市石林縣的1株白肉靈芝為材料，開展多基因系統發育分析、菌絲固體培養特性研究及馴化栽培試驗，并對子實體活性成分進行測定，旨在為云南野生靈芝的資源開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品子實體（編號HKAS 123767），于2019年由何俊采自云南省昆明市石林縣（海拔為1 979.67 m），經組織分離和純化獲得純菌株（編號為Lz-124）。子實體標本保存于中國科學院昆明植物研究所隱花植物標本館（KUN-HKAS），菌株保藏于云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所菌種庫。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

基礎培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.46 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

原種培養料配方：小麥80%、闊葉樹木屑10%、麥麩8%、石膏粉1%、白糖1%，含水量50%～55%；

栽培種（袋） 配方：闊葉樹木屑79%、麥麩18%、石膏1%、白糖2%，含水量50%～55%。

1.3 試劑

KOH（10%）、HCl（1.0 mol·L-1）、NaOH（1.0 mol·L-1）、植物基因組DNA提取試劑盒，北京擎科新業生物技術有限公司。

1.4 形態學鑒定

對供試樣品子實體和經組織分離后獲得的菌株進行宏觀和微觀形態觀察，并對各項特征進行詳細描述和圖版制作。

1.5 分子生物學分析

采用試劑盒提取靈芝子實體及菌絲體的DNA，針對樣品的ITS、TEF1-α及RPB2三個序列片段，使用引物ITS4/ITS5、TEF1-983/TEF1-1567和RPB2-6f/fRPB2-7cR[25]，以參考文獻[26]記載的方法進行PCR擴增。經凝膠電泳檢測后，將PCR原液送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。測序結果通過BLAST在線對比，同時從GenBank中下載靈芝屬其他樣品序列構建數據庫。在CIPRES Science Gateway上使用RAxML-HPC2 on XSEDE進行最大似然（ML） 系統發育樹構建[27]；系統發育樹用FigTree version 1.4.0進行可視化分析，并使用PowerPoint 2019進行編輯。

1.6 固體培養特性試驗

配制PDA培養基，混勻后于121℃、0.103 MPa條件下滅菌30 min，倒入90 mm培養皿中制成平板。將保藏的Lz-124菌株活化后轉接至培養皿中，待菌絲長滿培養皿后備用。

1.6.1 碳源單因子篩選試驗

在基礎培養基的基礎上，不加入葡萄糖作為空白對照（CK1），分別加入麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉替代葡萄糖作為供試培養基。采用直徑為7 mm的打孔器進行打孔，將菌塊接種至固體培養基中央，并置于22℃恒溫培養箱中避光培養，每組試驗設置5個重復。采用“十”字劃線法，每隔24小時測量1次菌落直徑，觀察并記錄菌絲形態及長勢。數據結果采用SPSS 20.0軟件的Duncan法比較差異顯著性（P<0.05），使用Excel 2019制作菌絲生長速度柱形圖。菌絲生長速率（V，mm·d-1）公式為：

式中：L表示菌落直徑（mm）；D表示培養天數（d）。

1.6.2 氮源單因子篩選試驗

在基礎培養基的基礎上，不加入蛋白胨作為空白對照（CK2），分別用氯化銨、硫酸銨、酵母粉、尿素替代蛋白胨作為供試培養基，接種、培養、設置重復及數據處理等方法同1.6.1。

1.6.3 無機鹽單因子篩選試驗

在基礎培養基的基礎上，不加入硫酸鎂作為空白對照（CK3），分別用三氯化鐵、碳酸鈣、七水合硫酸鋅、氯化鈉替代硫酸鎂作為供試培養基。接種、培養、設置重復及數據處理等方法同1.6.1。

1.6.4 溫度單因子篩選試驗

將菌塊接種至基礎培養基中，分別置于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃恒溫培養箱內避光培養。接種、培養、設置重復及數據處理等方法同1.6.1。

1.6.5 pH單因子篩選試驗

使用HCl（1 mol·L-1）和NaOH（1 mol·L-1）將基礎培養基的pH分別調為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0作為供試培養基，接種、培養、設置重復及數據處理等方法同1.6.1。

1.7 正交試驗

從單因素試驗中挑選出對菌絲生長速度影響較大的4個因素：碳源、氮源、無機鹽和溫度，從每個因素中選出較優的3個水平，采用L9（34）正交表進行4因素3水平正交試驗。

1.8 馴化栽培試驗

1.8.1 母種制備

將保藏的菌株Lz-124活化之后接種于直徑為90 mm的PDA培養基中，并置于22℃恒溫培養箱中避光培養備用。

1.8.2 原種制備

采用規格為8 cm×11 cm的玻璃瓶作為原種瓶，按1.2所述配方將培養料混合均勻，每瓶裝料質量為0.25 kg。將裝滿培養料的原種瓶至于121℃、0.103 MPa條件下滅菌2 h。待瓶內培養料溫度冷卻至30℃以下時開始接種，按照1瓶母種接種10瓶原種的比例接種，并置于室溫下培養備用。

1.8.3 栽培種制備

選用17 cm×35 cm×0.05 cm的聚乙烯袋作為栽培袋，按照1.2所述配方將培養料混合均勻后裝袋，每袋培養料質量為1 kg。將裝滿培養料的栽培袋至于121℃、0.103 MPa條件下滅菌2 h，待袋內培養料溫度冷卻至30℃以下，按照1瓶原種接種10袋栽培袋的比例接種，并置于室溫下培養。

1.9 出菇試驗

菌絲長滿栽培袋后繼續進行20 d的后熟培養，之后將栽培袋轉移至溫室大棚內進行覆土。首先在靈芝菌棒上端棒肩處開小孔（直徑為1 cm～3 cm），將開好孔的菌棒移入栽培槽內，開孔端向上，每個菌棒間隔10 cm，再在栽培槽上覆土（厚度為2 cm～5 cm）。在溫度為22℃～28℃，土壤濕度為30%，空氣濕度為80%～90%的條件下進行出菇管理。試驗設置5個重復小區，每個小區面積為1 m×10 m，每個小區栽培100個菌棒。待白肉靈芝生長進入成熟期，從5個小區中各隨機挑選20個菌棒采摘子實體，并記錄每個菌棒所采摘靈芝的平均鮮質量、干質量、菌蓋直徑、菌柄長度、菌柄直徑，并計算生物學效率（BE，%），計算公式為：

式中：Ffw為子實體鮮質量（g）；Sdw為培養料干質量 （g）。

1.10 靈芝子實體活性成分測定

將收集到的靈芝子實體于60℃烘干，粉碎并過80目篩后進行活性成分測定。氨基酸測定參照國家標準《食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124-2016）[28]的方法進行測定；礦質元素測定參照食品安全國家標準《食品中多元素的測定》（GB 5009.268-2016）[29]的方法進行測定；粗蛋白含量測定參照食品安全國家標準《食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5-2016）[30]的方法進行測定；脂肪含量測定參照國家標準《食品中脂肪的測定》（GB 5009.6-2016）[31]的方法進行測定；多糖、三萜含量測定參照《中國藥典》[32]的方法進行測定；靈芝酸測定參照《靈芝產品中靈芝酸含量的測定高效液相色譜法》（NY/T 2278—2012）[33]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

根據樣品子實體及菌株的形態學特征，將其鑒定為白肉靈芝（Ganoderma leucocontextum）[15]，野生白肉靈芝的形態特征見圖1。

圖1 野生白肉靈芝 (HKAS 123767)形態圖Fig.1 Morphology of wild Ganoderma leucocontextum(HKAS 123767)

如圖1所示，白肉靈芝生長于滇青岡（Cyclobalanopsis glaucoides） 腐木的基部。擔子果一年生，有柄，呈木栓質或木質。菌蓋匙形、半圓形至圓形，長軸為3 cm～10 cm，短軸為3.5 cm～7.0 cm，厚可達1.2 cm；菌蓋有漆狀光澤，呈紅褐色至深棕褐色。菌肉白色，有同心環紋，質地較軟，在成熟的擔子果中無黑色殼質線。菌柄側生或背側生，呈扁平狀或近圓柱形，表面光滑，有強烈漆狀光澤，紅褐色。皮層細胞棍棒狀，頂端略粗于底部，亮黃色，厚壁至亞實心，頂端或側面偶有分枝或突起，在成熟的擔子果中皮層細胞通常有中度至強烈的淀粉質反應。擔孢子卵圓形，大小為 （8.0～11.0） μm × （5.5～7.5）μm，臍狀突起不明顯，黃褐色，有淀粉質反應，雙層壁，外壁平滑，內壁表面有中度粗糙的點狀紋飾，未見擔子和擬擔子。

2.2 多基因分子系統發育分析結果

用于進行系統發育分析的靈芝屬樣品信息詳見表1。

如表1所示，Lz-124為試驗菌株采集號，本研究中共獲得ITS、TEF-α和RPB2三個片段。從GenBank中選擇了16個物種的序列（30條ITS序列，20條TEF-α序列和16條RPB2序列），選用Tomophagus colossus作為系統發育樹的外群。基于ITS、TEF1-α、RPB2序列構建最大似然 （Maximum Likelihood，ML） 分析靈芝屬系統發育樹，詳見圖2。

表1 研究采用的物種、標本、地理來源和GenBank登錄號Tab.1 Species,specimens,geographical origin and GenBank accession numbers used in the study

如圖2所示，試驗菌株Lz-124在系統發育中與已報道的白肉靈芝聚為一支[15]，支持率為80%。同時結合形態學特征，確定試驗中所采集的野生靈芝為白肉靈芝。

圖2 基于ITS、TEF1-α、RPB2序列最大似然（ML）分析靈芝屬系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Ganoderma based on Maximum likelihood(ML)analysis of combined ITS、TEF1-α and RPB2 sequence

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 碳源對菌絲生長速度的影響

不同碳源對菌絲生長速度及形態的影響結果見圖3。

由圖3可知，葡萄糖作為碳源時菌絲最為潔白和濃密，生長速度最快為（7.28±0.17） mm·d-1，與麥芽糖、蔗糖和CK1不存在顯著性差異。乳糖作為碳源時菌絲生長速度最慢，為（4.18±0.37） mm·d-1與可溶性淀粉不存在顯著性差異，且菌絲生長較其他碳源條件更潔白和濃密。

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。Note：Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

圖3 不同碳源條件下菌絲生長速度及形態圖Fig.3 Growth rate and morphology of mycelia under different carbon source conditions

2.3.2 氮源對菌絲生長速度的影響

不同氮源對菌絲生長速度及形態的影響結果見圖4。

由圖4可知，酵母粉作為氮源時菌絲最為潔白和濃密，生長速度最快，為（7.77±0.49） mm·d-1，與氯化銨、蛋白胨和CK2相比沒有顯著性差異。尿素作為氮源時菌絲生長速度最慢，為（1.60±0.40）mm·d-1，與其他氮源條件存在顯著性差異。

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。Note：Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

圖4 不同氮源條件下菌絲生長速度及形態圖Fig.4 Growth rate and morphology of mycelia under different nitrogen source conditions

2.3.3 無機鹽對菌絲生長速度的影響

不同無機鹽對菌絲生長的影響結果見圖5。

由圖5可知，三氯化鐵作為無機鹽時菌絲較為潔白，但濃密程度略低于其余條件，生長速度最快為（8.00±0.22） mm·d-1，與其余無機鹽存在顯著性差異。碳酸鈣為無機鹽時菌絲生長速度最慢，為（5.21±0.67） mm·d-1，與氯化鈉作為無機鹽不存在顯著性差異，碳酸鈣和氯化鈉作為無機鹽時，菌絲最為濃密，但生長速度較慢。

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。Note：Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

圖5 不同無機鹽條件下菌絲生長速度及形態圖Fig.5 Growth rate and morphology of mycelia under different inorganic salt conditions

2.3.4 溫度對菌絲生長速度的影響

不同溫度對菌絲生長速度及形態的影響結果見圖6。

由圖6可知，溫度為26℃時，白肉靈芝菌株Lz-124的菌絲最為潔白且濃密；生長速度最快為（7.28±0.21） mm·d-1，與溫度為24℃時不存在顯著性差異。當溫度為28℃時，菌絲生長速度最慢，為（4.17±0.22） mm·d-1，與其余溫度條件存在顯著性差異。

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。Note：Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

圖6 不同溫度條件下菌絲生長速度及形態圖Fig.6 Growth rate and morphology of mycelia at different temperatures

2.3.5 pH對菌絲生長速度的影響

不同pH條件對菌絲生長速度及形態的影響結果見圖7。

由圖7可知，白肉靈芝菌株Lz-124在pH 5.5條件下培養時菌絲濃密程度略低于其余pH條件，但菌絲生長速度最快，為（7.68±0.15） mm·d-1，與其余pH條件存在顯著性差異。pH為7.0時菌絲最為潔白且濃密，但生長速度最慢，為（5.70±0.16） mm·d-1，與pH為6.5時相比不存在顯著性差異。

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。Note：Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

圖7 不同pH條件下菌絲生長速度及形態圖Fig.7 GrowthrateandmorphologyofmyceliaunderdifferentpHconditions

2.4 正交試驗結果

結合以上單因素試驗結果，從中挑選出較優的4個因素，從每個因素中選出較優的3個水平，采用L9（34）正交表進行4因素3水平正交試驗，共計9組。4因素3水平表見表2。白肉靈芝菌絲生長的正交試驗結果見表3。

表2 正交試驗4因素3水平表Tab.2 The orthogonal test table of 4 factors and 3 levels

表3 白肉靈芝菌絲生長的正交試驗結果的直觀分析Tab.3 The results of direct-viewing analysis of mycelial growth of Ganoderma leucocontextum

如表3的正交分析結果可見，溫度對菌絲生長速度的極差最大，R為1.60，其次是氮源、無機鹽和碳源。結合X與R分析得出最佳配方為A2B1C1D1。

對正交試驗結果進行方差分析，結果詳見表4。

表4 白肉靈芝菌絲生長的正交試驗結果方差分析Tab.4 The results of F-test of myelial growth of Ganoderma leucocontextum

如表4所示，溫度的F值最大，其次是無機鹽、氮源和碳源。因此4因素顯著性差異由大到小依次是溫度>無機鹽>氮源>碳源。

2.5 馴化栽培試驗結果

試驗中白肉靈芝馴化栽培平均現蕾時間為25 d，分化時間為82 d，成熟期為116 d。

測量白肉靈芝子實體的農藝性狀并計算生物學效率，結果詳見表5。

由表5可知，云南白肉靈芝馴化栽培的子實體單朵鮮質量平均為（61.60±5.80） g，干質量平均為（24.80±5.50） g；菌蓋直徑平均為 （13.04±1.30） cm；菌柄長度平均為（7.06±1.63） cm，菌柄直徑平均為（2.75±0.50） cm；平均生物學效率為（10.26±0.97）%。

表5 白肉靈芝農藝性狀和生物學效率Tab.5 Agronomic traits and biological efficiency of Ganoderma leucocontextum

記錄白肉靈芝生長中的形態詳見圖8。

圖8 白肉靈芝發育過程中不同形態Fig.8 Different forms of Ganoderma leucocontextum during development

由圖8可知，馴化栽培的白肉靈芝菌蓋呈現不規則扇形，表面具有光澤，菌蓋中部顏色呈深棕褐色向外顏色逐漸變淺，菌蓋邊緣呈黃乳白色，表面具有同心溝紋，菌柄為單支或多分支。

2.6 活性成分測定結果

白肉靈芝活性成分含量測定結果詳見表6。

如表6所示，在白肉靈芝子實體中共檢測出18種氨基酸，總氨基酸含量為17.24%，必需氨基酸含量為6.81%，組氨酸含量最高為2.81%；蛋白質含量為17.20%；硒含量為0.06 mg·kg-1；脂肪含量為2.40%；靈芝多糖含量為1.51%，三萜含量為3.21%，靈芝酸含量為 11.20 mg·100-1g-1。

表6 白肉靈芝活性成分Tab.6 Active ingredient of Ganoderma leucocontextum

3 討論

基于ITS、TEF1-α和RPB2序列，采用最大似然法對供試樣品進行系統發育分析，結合形態學特征，將樣品鑒定為白肉靈芝Ganoderma leucocotextum。

通過開展碳源、氮源、無機鹽、溫度、pH單因素試驗，得出最適條件為無碳源、氮源為酵母粉、無機鹽為三氯化鐵、溫度為26℃，pH為5.5。該結果與其他靈芝最適固體培養條件相比存在一定的差異，詳見表7。

如表7所示，在碳源方面，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和CK1作為碳源時，菌絲生長速度沒有顯著性差異，表明白肉靈芝對碳源的吸收較為廣泛，最適碳源有待進一步探索。報道的白肉靈芝、有柄靈芝（Ganoderma gibbosum）、赤芝、樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）和靈芝在乳糖作為碳源的情況下生長速度均最慢，與本研究中結果一致[34-38]。整體來看，不同靈芝品種菌絲固體培養對于復合碳源的吸收優于單一碳源。在氮源方面，白肉靈芝最適氮源為酵母粉，與樹舌靈芝和韋伯靈芝試驗結果相一致，綜合比較發現不同靈芝品種對有機氮的吸收均優于無機氮[37,40]。在無機鹽方面，三氯化鐵條件下菌絲生長最好。在溫度方面，固體培養最適溫度為26℃，與莫偉鵬等[34]研究的白肉靈芝最適溫度相近。很多栽培靈芝屬于高溫型食（藥）用菌，最適生長發育溫度為25℃～30℃；而白肉靈芝最適生長發育溫度為22℃～26℃，明顯低于普通靈芝品種，屬于中低溫型物種[35-40]。在pH方面，最適pH為5.5，與莫偉鵬等[34]研究的白肉靈芝最適pH為3.0有差異，大多數靈芝最適pH為6.0～7.0之間，可見白肉靈芝較其他靈芝更適宜在酸性條件生長。

表7 白肉靈芝與其他靈芝屬真菌菌絲培養特性對比Tab.7 Comparison of mycelial culture characteristics between Ganoderma leucocontextum and other Ganoderma spp.

結合正交試驗結果，發現不同單因素對菌絲生長速度影響由大到小依次是溫度>無機鹽>氮源>碳源；最佳培養組合為葡萄糖、蛋白胨、三氯化鐵、26℃。四川靈芝（Ganoderma sichuanense） 不同單因素影響排序為碳源>氮源>pH>無機鹽[41]，與本研究存在較大差異，表明不同單因素對不同靈芝物種菌絲生長的影響存在差異。

為進一步明確云南白肉靈芝的農藝性狀，開展了馴化栽培試驗。采用袋料覆土栽培成功馴化白肉靈芝，白肉靈芝單朵干質量為（24.80±5.50） g。姚春馨等[42]研究的“云白靈芝2號”平均產量為干品38 g/袋，單朵干質量略高于本研究中結果。胡惠萍等[43]研究的西藏白肉靈芝單朵干質量為（12.40±1.13） g，單朵干質量略低于本研究白肉靈芝。目前廣泛栽培的赤芝[44]單朵平均干質量為25.91 g，紫芝[45]單朵鮮質量為（237.50±10.33）g，云南白肉靈芝子實體質量優于赤芝，但與紫芝子實體質量相比存在一定差距。目前，針對白肉靈芝農藝性狀的研究大多僅包括出菇產量及周期，但其余農藝性狀的相關研究較少，有待進一步深入分析。

對馴化栽培的白肉靈芝子實體進行活性成分檢測。白肉靈芝含有7種人體必需氨基酸，同時還含有蛋白質、多糖、脂肪、三萜、微量元素、靈芝酸等物質。與不同靈芝活性成分對比情況詳見表8。

如表8所示，試驗中的白肉靈芝總氨基酸、蛋白質、脂肪、多糖、三萜均優于紫芝和赤芝[46-47]。與潘俊等[48]研究的白肉靈芝進行對比，本研究白肉靈芝總氨基酸、總三萜含量顯著較高，其余活性成分差異較小。

表8 白肉靈芝與其他靈芝屬真菌子實體活性成分對比Tab.8 Comparison of active components of fruiting bodies of Ganoderma leucocontextum and other Ganoderma spp.

綜合上述結果表明，云南白肉靈芝生物學效率高，含有大量的活性物質，因此云南白肉靈芝具有巨大的市場潛力和開發價值。