1株野生靈芝的分離鑒定及生物學特性分析*

劉冬梅，孫雪言，嚴碧云，陳澤群，刁文彤，梁呈元**

（1.江蘇省中國科學院 植物研究所，江蘇 南京 210014；2.武漢工程大學，湖北 武漢 430205；3.武昌工學院，湖北 武漢 430065）

靈芝（Ganoderma lucidum）俗稱“赤芝”，為多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma） 真菌。靈芝作為我國重要的傳統中藥，始載于最早的藥物學專著《神農本草經》，具有扶正固本、延年益壽之功效，被歸為上品；如今被《中華人民共和國藥典》收載，是法定的中藥藥材[1]。研究發現，靈芝富含三萜、多糖等多種活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、保護神經、改善肝功能、抗氧化、抗病毒等廣泛藥理作用，臨床上常用于輔助治療慢性支氣管炎、消化不良、神經衰弱、高血壓、高血糖、肝炎和癌癥等[2-4]。近年來，隨著人們保健意識的增強，靈芝產品的開發越來越受到重視。目前，我國靈芝主栽品種大多引自國外，易出現菌種活性退化、子實體品質難以控制等問題[5]。因此在保護生態環境的前提下，充分發掘野生資源、豐富靈芝菌種資源仍是一項重要的工作。

通過對1株采集自南京紫金山的野生菌株子實體進行組織分離、菌絲純化，得到菌株ZJ-1，并以形態學觀察和ITS序列分析相結合的方法進行品種鑒定。同時開展菌株ZJ-1的生物學特性、馴化栽培及孢子觀察等試驗，以期為紫金山野生資源開發提供參考，為開展靈芝子實體發育、孢子形成等機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

野生菌株的子實體，采自江蘇省南京市紫金山的一片落葉地。挑選尚未木質化、無破損的子實體，用袋子裝好帶回實驗室。

1.1.2 培養基及培養料

PDB培養基：取去皮馬鈴薯200 g，均勻切片后于鍋中煮沸20 min，濾網過濾除渣，加入葡萄糖20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養基：1 L的PDB中加入瓊脂15 g。

基礎培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂15 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

栽培培養料（配比以質量分數表示）：木屑20%、棉籽殼58%、麩皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量為60%左右，121℃高壓滅菌180 min。

1.1.3 主要儀器及試劑

主要儀器：GI54DS高壓蒸汽滅菌鍋，致微儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇凈安泰設備有限公司；DNP-9082恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；ETC821 PCR擴增儀，南京喬貝琳生物科技有限公司；JY300C電泳儀、JY04S-3E凝膠成像系統，北京君意東方電泳設備有限公司；QUANTA 200掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

主要試劑：CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）和引物合成，上海生工生物工程有限公司；高保真酶、TA克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；感受態細胞DH5α、PCR產物純化試劑盒，南京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化

用水沖洗菌株幼嫩子實體表面的泥土，去掉菌柄后用75%乙醇進行表面消毒，用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，然后將子實體掰開。在菌蓋及菌蓋與菌柄交界處切取米粒大小的組織放在PDA平板培養基上，用封口膜封口后于28℃培養箱培養。每天觀察菌絲生長情況，將未污染的菌絲轉接到PDA斜面培養基上，4℃保藏。

1.2.2 菌種的鑒定

1） 形態學特征

用無菌打孔器在生長著新鮮菌絲的PDA平板培養基上打孔，接種于新的PDA平板培養基中央，置于28℃培養箱培養1周，觀察菌絲的生長情況。將滅菌后的蓋玻片斜插入含有菌絲的PDA平板培養基中，待菌絲生長至蓋玻片上后觀察菌絲的顯微結構。

2）ITS序列擴增與測序

采用CTAB法提取靈芝菌絲的基因組DNA[6]。以提取的DNA為模板，使用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將片段大小正確的PCR產物純化后連接T載體，轉化到大腸桿菌DH5α中。挑取單克隆，經PCR檢測后送到上海生工生物工程有限公司測序。

3）系統發育樹的構建

所得ITS序列在NCBI數據庫中進行同源比對，以硬毛革孔菌（Coriolopsis caperata） 為外群[7]，用MEGA 5.0軟件采用鄰接法NJ（neighbor-joining method）構建系統發育樹，Bootstrap參數設定為1 000。

1.2.3 菌絲培養特性研究

1） 溫度對菌絲生長的影響

在直徑為5.5 cm的PDA平板培養基上用打孔器接種直徑為7 mm的菌絲塊，分別于20℃、25℃、28℃、32℃和37℃避光培養，每個處理設置3個重復。當有一組菌絲長滿平板時，采用“十”字交叉法測量全部供試菌落直徑，并記錄菌絲生長情況[8]。

2）pH對菌絲生長的影響

用0.1 mol·L-1的HCl和NaOH調節PDA培養基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。接種、培養及測量方法同上。

3）碳源對菌絲生長的影響

以不加葡萄糖的基礎培養基為對照（CK），配制分別以葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油作為碳源的培養基。接種、培養及測量方法同上。

4）氮源對菌絲生長的影響

以不加蛋白胨的基礎培養基為對照（CK），配制分別以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、氯化銨、尿素和麩皮作為氮源的培養基。接種、培養及測量方法同上。

1.2.4 出菇試驗

為了檢測菌種純度及驗證分離的菌絲是否具有出菇能力，選用袋料栽培的方法進行出菇試驗。每個菌袋裝濕料約800 g，在培養料中間插入一個長度為16 cm的打孔棒，封口后于121℃條件下高壓滅菌3 h，冷卻至室溫后于無菌超凈臺取出打孔棒，將準備好的母種填滿孔洞，完成接種。將菌袋置于28℃避光培養。

1.2.5 菌管的顯微觀察

待子實體成熟后，縱切其菌管部位，用炭膜將切片粘在掃描電鏡的樣品臺上，噴上一薄層導電金，用掃描電鏡觀察。

1.2.6 數據處理與統計分析

采用Excel 2013軟件進行基礎數據處理，結果用平均值±標準差表示。通過SPSS 16軟件進行統計分析，檢測其差異顯著性（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 野生子實體形態特征

在南京市紫金山的一片落葉地采集到的野生子實體的形態見圖1。

圖1 野生菌株子實體形態Fig.1 The fruiting bodies morphology of wild strains

如圖1所示，幼小子實體邊緣呈黃白色，較嫩；成熟子實體較小，菌蓋呈腎型，表面紅褐色，有似漆樣光澤；有菌柄，菌柄側生且較短。通過形態學觀察發現，采集到的野生子實體符合典型靈芝的形態特征。

2.2 分離純化后菌絲的形態特征

對野生菌株進行組織分離培養，組織塊在PDA平板培養基中培養2 d～3 d，菌蓋及菌蓋與菌柄交界處的組織塊均有少量白色棉絮狀菌絲長出，將其命名為ZJ-1。菌株ZJ-1的菌絲生長1周時的觀察結果見圖2A。挑取組織塊邊緣的菌絲接種到直徑為9.0 cm的PDA平板培養基上，大約7 d可長滿，得到純化后的菌株ZJ-1，其菌絲生長情況及菌落形態見圖2B，菌絲形態觀察見圖2C。

圖2 組織分離培養（A） 以及純化菌株ZJ-1的菌落（B）、菌絲（C） 形態觀察Fig.2 Tissue isolation culture(A),colony(B)and mycelia(C)morphology observation of purified strain ZJ-1

如圖2所示，純化菌株ZJ-1的菌落呈規則圓形，邊緣整齊，無分泌物；菌絲潔白純凈，濃密，顏色一致。微觀形態顯示，菌株ZJ-1的菌絲細長，粗細均勻，有分枝，且具有鎖狀聯合結構（圖2C箭頭指示位置）。

2.3 菌株ZJ-1的ITS序列分析

經PCR擴增和測序分析，獲得長度為636 bp的ITS序列，將ITS序列提交至GenBank數據庫，獲得登錄號MW362341。根據BLAST比對結果并結合文獻報道，以硬毛革孔孔菌Coriolopsis caperata為外群，選擇靈芝屬不同真菌的ITS序列構建系統發育樹[7]，詳見圖3。

圖3 基于ITS序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖3可知，菌株ZJ-1在系統發育樹上與Ganoderma lucidum聚為一支，支持率為100%。結合形態學特征，將菌株ZJ-1鑒定為靈芝Ganoderma lucidum。

2.4 菌絲培養特性研究

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響

5個不同溫度條件下靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表1。

表1 溫度對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.1 Effect of temperature on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表1可知，靈芝菌株ZJ-1在20℃～37℃的培養條件下均可生長；溫度為20℃、25℃和37℃時生長較慢，但生長速度差異不顯著；溫度為28℃、32℃時生長速度最快，菌絲最濃密，生長速度差異也不顯著。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1菌絲生長最適溫度為28℃～32℃。

2.4.2 pH對菌絲生長的影響

6個不同pH條件下靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表2。

由表2可知，靈芝菌株ZJ-1在pH為4.0～9.0的培養基中均能生長，且pH為4.0～7.0時菌絲長勢均較好。其中，培養基pH為4.0和5.0時，菌絲生長最好；pH為6.0和7.0時，菌絲生長速度略有減慢；當pH高于7.0時，菌絲生長速度明顯變慢。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的最適pH為4.0～5.0。

表2 pH對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.2 Effect of pH on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.4.3 碳源對菌絲生長的影響

8種不同碳源培養基中靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表3。

表3 碳源對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.3 Effect of carbon source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表3可知，靈芝菌株ZJ-1在添加不同碳源的培養基中均可生長，但菌絲對碳源的利用能力不同。以可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖為碳源時菌絲生長最快；其次為果糖和葡萄糖；最慢的為乳糖。對照組中菌絲也能生長，但菌絲長勢較弱。以乳糖為碳源時，菌絲生長速度與無碳源對照組相比差異不顯著，但菌絲比對照組更潔白、致密，說明碳源是菌絲生長的重要營養成分。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長最適碳源為可溶性淀粉。

2.4.4 氮源對菌絲生長的影響

不同氮源培養基中靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表4。

表4 氮源對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表4可知，靈芝菌株ZJ-1在以酵母粉、麩皮為氮源的培養基上生長速度最快，但以麩皮為氮源時，菌絲長勢弱；其次為牛肉膏和蛋白胨；以氯化銨和尿素為氮源時，菌絲幾乎不生長或略有生長；無氮源對照組（CK）菌絲不生長。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1的最適氮源為酵母粉。

2.5 出菇試驗結果

對靈芝菌株ZJ-1進行出菇試驗，子實體發育過程中的形態變化及特點詳見圖4。

如圖4所示，靈芝菌株ZJ-1在栽培培養料中生長較快，28℃時菌絲長滿菌袋約需20 d。菌絲滿袋后，在菌袋上部開口，移入具有散射光的菇房中。袋口的菌絲開始扭結，大約7 d形成原基。條件適宜時，原基進一步分化形成子實體，待靈芝子實體成熟時，便從子實體腹面的菌管（圖4D箭頭指示位置）處噴射孢子。

圖4 靈芝菌株ZJ-1的子實體形態變化及特點Fig.4 Morphological changes and characteristics of fruit bodies of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.6 掃描電鏡顯微觀察

利用掃描電鏡觀察成熟靈芝子實體的菌管結構及孢子，詳見圖5。

圖5 靈芝菌株ZJ-1的顯微觀察Fig.5 Microscopic observation of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由圖5A可看出，靈芝菌管內具有規則的網狀結構，其上布滿孢子。由圖5B可看出，靈芝孢子個體非常小，約為7.0 μm×4.2 μm；在電子顯微鏡下將其放大5 000倍時，可見其個體呈卵形，外壁平滑，表面布滿小孔，頂端平截。

3 討論

生產實踐經驗證明，大多引自國外的靈芝主栽品種易出現菌種活性退化、子實體品質難以控制等問題[5]。在生態環境保護的前提下，鑒定和馴化了南京市紫金山野生靈芝菌株，可為開發當地靈芝種質資源奠定基礎。

野生大型真菌的鑒定方法主要有經典分類鑒定方法和分子水平鑒定方法。經典分類鑒定方法主要為觀察菌絲和子實體的形態，是最基本且不可替代的方法，但由于野生子實體分布廣泛，容易受到外界環境的影響而出現形態不穩定的情況，因此還需借助分子水平鑒定方法進行確認[9]。本次試驗中除了觀察菌絲和子實體的形態，還結合ITS序列分析法鑒定菌株ZJ-1的分類地位，通過BLAST比對及系統發育分析，將菌株ZJ-1鑒定為靈芝Ganoderma lucidum。

王慶武等[10]發現泰山靈芝4914的適宜生長溫度為25℃～30℃，適宜pH為6.0～7.0，最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母膏。馬博等[7]發現有柄靈芝（Ganoderma gibbosum） BSU01的最適生長溫度為30℃，最適pH為5.5，最適碳源為果糖或葡萄糖，最適氮源為酵母提取物。努爾阿麗耶·阿卜力米提等[11]報道的新疆靈芝菌株XJ-001最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉。蔣帥等[12]報道的韋伯靈芝（Ganoderma weberianum） 適宜生長溫度為28℃～32℃，適宜pH為6.0，最適碳源為糊精，最適氮源為酵母粉。而此次試驗結果表明，靈芝菌株ZJ-1的最適溫度為28℃～32℃，與韋伯靈芝一致；適宜pH為4.0～5.0，與上述4種菌株相比偏酸性；最適碳源為可溶性淀粉，不同于上述菌株；最適氮源為酵母粉，與泰山靈芝4914、有柄靈芝BSU01和新疆靈芝XJ-001均一致。靈芝菌株ZJ-1的生物學特性與其他報道的研究結果既有一致性，又存在差異，可能是供試菌株來源不同及基礎培養基的成分不同所致。與野生子實體相比，馴化栽培后的子實體菌蓋厚實，并且能產生大量孢子。經電鏡觀察發現菌管表面布滿孢子；孢子個體呈卵形，外壁平滑，表面布滿小孔，頂端平截。靈芝孢子因具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用，近年來其相關產品亦備受消費者青睞，可加以開發[13]。

上述研究結果可為紫金山野生靈芝資源開發提供參考，為開展靈芝子實體發育、孢子形成的機制研究奠定基礎。