不同皮色洋蔥花青素合成酶基因片段的克隆及苗期表達分析

王振寶，徐宏志，劉冰江，霍雨猛，孫亞玲，李艷偉，吳雄，楊妍妍

(1. 山東省農業科學院蔬菜研究所，山東 濟南 250100；2. 東北農業大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

洋蔥(Allium cepaL.)又名圓蔥、蔥頭、球蔥等，為百合科蔥屬二年生草本植物。洋蔥于近代傳入我國，由于具有適應性強、耐貯藏和運輸的特點，在我國廣泛栽培，是一種重要的出口創匯蔬菜[1]。洋蔥以肉質鱗莖為主要食用器官，營養物質豐富，有“蔬菜皇后”的美譽；洋蔥中含有的類黃酮、有機硫等還有一定的藥用和保健作用，其中類黃酮具有調節血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血栓形成、消炎等作用[2]。

鱗莖顏色是洋蔥的一個重要性狀，主要有紫、紅、黃、白等顏色。類黃酮類化合物是洋蔥鱗莖產生不同顏色的主要因素。花青素作為一種重要的類黃酮類天然水溶性色素，廣泛分布于植物細胞液中，是植物花、果實和儲藏器官等呈現不同顏色的主要色素之一[3]。植物花青素生物合成途徑的研究已較為成熟，是以直接前體苯丙氨酸為底物，經過一系列酶的催化，最終形成穩定的花色苷[4]。花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)位于花青素生物合成途徑的倒數第二步，是花青素生物合成途徑末端的限速酶，能催化無色花色素轉化為有色花色素，其表達水平的高低會影響植物組織器官中花色苷的累積，從而產生不同的顏色[5]。

目前，已經從花生、黑稻、蘋果、東方百合等多種植物中克隆了ANS基因[6－9]，而且研究發現ANS基因的表達具有組織特異性和品種特異性，如黑果枸杞果實中LrANS基因的表達量顯著高于其他組織，表達量由高到低依次為黑果、紫果、綠果、花、葉、莖、根[10]；紫心甘薯塊根、莖、葉中ANS基因的表達水平顯著高于白心甘薯[11]。但有關洋蔥ANS基因的研究相對較少，繆軍等[12]2010年克隆了洋蔥花青素合成酶基因AcANS，并進行了生物信息學分析；Kim等[13]2016年鑒定出了2 個突變的ANS等位基因，能造成洋蔥花青素合成酶失活，從而影響花青素合成。本研究以30 天苗齡的紫皮和黃皮洋蔥幼苗為試材克隆ANS基因片段，并對其在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達特性進行研究，以期為洋蔥ANS基因全長序列獲得和功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紫皮洋蔥育種系175F 和黃皮洋蔥育種系DH17－1 的30 天苗齡幼苗，均定植于山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地。于2021年10月13 日分別取幼苗的新鮮根、葉鞘和葉片，迅速放入液氮中冷凍，于－80℃保存備用。

1.2 洋蔥總DNA、總RNA 的提取及cDNA 制備

洋蔥基因組總DNA 采用快捷型植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，具體操作參照說明書。

洋蔥總RNA 采用Trizol(Invitrogen 公司)法提取，參照說明書進行操作。取完整性良好的總RNA，利用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶生物工程大連有限公司)反轉錄合成cDNA。

1.3 PCR 擴增

分別以洋蔥基因組DNA 和反轉錄合成的cDNA 為模板擴增洋蔥花青素合成酶基因片段。所用目的基因上游引物AcANS－F 序列為5′－CTAACGATCAATCTAAAGGGA － 3′， 下游引物AcANS－R 序列為5′－GCAGTATGAACGATAAGGCAC－3′，由青島蔚來生物科技有限公司合成。

PCR 反應總體積為25 μL，其中，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，用滅菌蒸餾水補齊至25 μL。擴增程序為:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，35 個循環；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上檢測，并拍照記錄。

PCR 擴增產物送青島蔚來生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

利用DNAMAN 和Blast(http:/ /www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行序列比對分析。

1.5 基因表達量測定

分別從兩種皮色洋蔥幼苗的根、葉鞘和葉片中提取RNA，反轉錄為cDNA。以Actin為內參[14]，上游引物AcActin－F 序列為5′－ACACGGCCTGGATAGCAACAT－3′，下游引物AcActin－R序列為5′－AGAGCAGTATTCCCAAGCATT－3′，由青島蔚來生物科技有限公司合成。PCR 反應體系參照1.3，通過PCR 擴展產物條帶的亮度將cDNA 模板調整為基本一致的濃度，擴增程序為:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，30 個循環；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上檢測，并拍照記錄。然后用基因特異引物AcANS－F 和AcANS－R 進行PCR擴增，擴增程序同上，擴增30 或35 個循環，擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上檢測，并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 AcANS 基因片段克隆

根據已報道的花青素合成酶基因序列設計引物，分別以紫皮和黃皮洋蔥的基因組DNA 和反轉錄合成的cDNA 為模板進行擴增，均擴增出1 條特異條帶(圖1)。以基因組DNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴增出約510 bp 的目的片段，與預期片段大小相吻合；以反轉錄合成的cDNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴增出約400 bp 的目的片段。分別將目的片段回收測序。

圖1 不同皮色洋蔥幼苗中AcANS 基因的PCR 擴增結果

2.2 AcANS 基因片段序列比對分析

經測序分析和Blast 比對，克隆到的目的基因片段序列與已報道的洋蔥ANS等位基因序列的相似度均在97%以上，確認為AcANS基因片段。利用DNAMAN 軟件對從兩種皮色洋蔥中克隆的AcANS基因片段序列進行對比分析，由圖2 可以看出，克隆得到的兩種皮色洋蔥的AcANS基因組序列長度均為497 bp，堿基序列也完全一致，不存在多態性位點；兩種皮色洋蔥AcANS基因的編碼序列長度均為390 bp，堿基序列也完全一致，且編碼區包含一個107 bp、符合GT－AG 規則的內含子。表明克隆得到的兩種皮色洋蔥AcANS基因完全一致，且無多態性位點。

圖2 不同皮色洋蔥AcANS 基因組序列與編碼序列比對結果

2.3 不同皮色洋蔥AcANS 基因的組織表達特性

以Actin基因作為內參，采用半定量RT－PCR對紫皮和黃皮洋蔥幼苗根、葉鞘、葉片中的AcANS基因表達情況進行分析，結果(圖3)顯示，兩種皮色洋蔥的AcANS基因均表現為葉鞘中表達量最高，葉片中次之，根中不表達；在相同條件下，紫皮洋蔥葉鞘和葉片中AcANS基因的表達量明顯高于黃皮洋蔥，且在擴增30 個循環時，紫皮洋蔥葉鞘中可以檢測到AcANS基因的表達，而黃皮洋蔥中未檢測到。說明洋蔥苗期AcANS基因的表達具有組織特異性，后期顏色越深的部位AcANS基因的表達量越高，而且紫皮洋蔥中AcANS基因的表達量更高，這為后期鱗莖顏色不同奠定了基礎。

圖3 AcANS 基因在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達情況

3 討論與結論

花色苷的合成需要PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等結構基因的參與[4]，這些基因的表達或表達量上調都可以造成植物組織器官中花色苷的累積，從而產生顏色上的差異。花青素合成酶(ANS)可以催化無色花青素轉化為有色花青素[15]。ANS基因的表達與花青素的累積量呈正相關，顏色越深或越鮮艷的組織部位中ANS基因的表達量越高[15－17]。本研究結果也表明，AcANS基因在洋蔥幼苗的葉鞘中表達量最高，其次是葉片中，根中不表達，而且紫皮洋蔥中的表達量明顯高于黃皮洋蔥，這為后期鱗莖產生顏色上的差異奠定了生物學基礎。

花青素合成途徑相關結構基因的表達受轉錄因子和外界環境因素的共同調控，轉錄因子主要包括MYB、bHLH 和WD40 三大類[18]。MYB 轉錄因子是植物花青素合成途徑最廣泛的調節因子，也是花青素生物合成中MBW 復合物的主要調控因子，能夠正、負調控植物花青素的合成。如在轉基因煙草中過表達PsMYB58基因能夠顯著上調煙草花青素生物合成途徑中ANS等結構基因的表達[19]；在水仙中過表達NtMYB2基因能夠抑制水仙花青素生物合成途徑各結構基因的表達[20]。此外，MYB 轉錄因子還可以與其它轉錄因子如bHLH、WD40 等共同作用，形成MBW 復合物，調控花青素的合成。本研究分別克隆了紫皮、黃皮洋蔥的AcANS基因片段，序列比對結果表明兩個片段不論基因組序列還是編碼序列都完全一致，也不存在多態性位點，并且AcANS基因在兩種皮色洋蔥中均能正常轉錄，但轉錄水平存在明顯差異，在紫皮洋蔥中的轉錄水平明顯高于黃皮洋蔥，推斷這種差異的產生可能是MYB 等轉錄因子調控的結果，因此，后續有必要克隆洋蔥MYB 轉錄因子，研究其與AcANS基因以及花青素生物合成途徑其他結構基因的關系。

洋蔥定植前很難通過幼苗準確判斷后期蔥球的顏色，而實際生產中，在種子或幼苗階段就能鑒定出皮色對于洋蔥種子純度檢測及種質資源鑒定具有重要意義。吳雄等[21]對洋蔥花蕾期可育群體和不育群體進行cDNA－SRAP 分析獲得了差異表達片段，在此基礎上開發了可以鑒定洋蔥細胞核育性恢復基因的cDNA 分子標記，該分子標記僅在恢復系花蕾中存在擴增，而其它組織部位和育性材料中均不存在擴增，可以有效鑒定洋蔥恢復系材料。鑒于此，本研究利用AcANS基因表達水平的差異，以30 天苗齡紫皮、黃皮洋蔥葉鞘cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增30 個循環時，所有紫皮洋蔥中均有特異性擴增片段，而黃皮洋蔥中無擴增，因此可以作為cDNA 分子標記用于在洋蔥30 天苗齡時判斷后期蔥球的顏色，與傳統的田間小區種植鑒定相比所需時間短、用地少、成本低、在苗期即可達到鑒定種子純度的目的，可應用于洋蔥種質資源鑒定和輔助育種等方面。

本研究克隆了不同皮色洋蔥AcANS基因部分基因組序列和編碼序列，為全長基因序列的克隆奠定了基礎；分析了AcANS基因在兩種皮色洋蔥幼苗各組織中的表達情況，發現其表達具有明顯的組織特異性和品種特異性，這為進一步弄清洋蔥鱗莖不同皮色發生的分子機制提供了參考。另外發現，可利用不同皮色洋蔥葉鞘中AcANS基因表達水平的差異作為cDNA 分子標記，在30 天苗齡時就區分出紫皮和黃皮洋蔥。