轉基因玉米MON87419實時熒光定量PCR檢測方法的建立

李凌燕，陳紅，馬玥，張旭冬，陳子言，王顥潛，張秀杰，梁晉剛

(1. 農業農村部科技發展中心，北京 100176；2. 北京農業職業學院，北京 102442)

近年來，轉基因作物的種植和商業化在全球范圍內迅速發展。國際農業生物技術應用服務組織(ISAAAA)統計結果表明，截至2018年全球已經有70 多個國家種植進口轉基因作物，轉基因作物種植面積已經達到1.9 億hm2[1]。隨著轉基因作物的大范圍推廣，轉基因產品標識制度已經成為全球轉基因監管的重要手段。我國頒布?農業轉基因生物標識管理辦法?對我國轉基因作物進行管控[2]以保護消費者的知情權，而建立可靠的定量檢測方法是保障轉基因生物標識制度順利實施的必然技術要求。

實時熒光定量PCR 技術是利用PCR 擴增過程中熒光信號的積累，實現對PCR 反應進程的實時監測，最后通過建立雙標準曲線以達到對DNA 定量分析的目的，具有高靈敏性、可檢測單個細胞基因、高特異性和準確性、操作簡單快捷和安全無污染等優點。目前大多數轉基因作物品系如轉基因玉米[3]、水稻[4]、棉花[5]等已經建立PCR 定量檢測系統。

轉基因玉米MON87419 是由孟山都遠東有限公司開發的轉基因耐除草劑玉米，其中插入耐除草劑基因(dom、pat)，表現出對麥草畏和草銨膦良好的抗性。目前國內外還沒有對該轉基因作物的定量檢測方法， 因此建立轉基因玉米MON87419 的定量檢測方法對其有效監管和轉基因的檢測評價是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 轉基因玉米MON87419 及其受體玉米種子均為2019年由孟山都遠東有限公司提供。

其他轉基因玉米混樣、轉基因大豆混樣、轉基因水稻混樣、轉基因油菜混樣、轉基因棉花混樣和非轉基因大豆、玉米、棉花等樣品均由本實驗室保存。各種混樣的制備方法:多種轉化體按1%質量百分比混合而成，不足部分用相應的非轉基因作物補齊(表1)。

表1 轉基因作物混合樣品

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA 提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；TaqManTMGene Expression Master Mix、DL1000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器設備 臺式冷凍離心機(Eppendorf)；Q5000 超微量紫外分光光度計(Quawell)；CFX 96熒光定量PCR 擴增儀(Bio－Rad，美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 提取 將轉基因耐除草劑玉米MON87419 及其受體種子育苗。按照植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書提取玉米植株基因組DNA，其余轉基因混樣和非轉基因樣品分別提取DNA，分光光度計測定濃度，用1×TE 緩沖液稀釋至50 ng/μL 用于后續試驗。

1.2.2 引物設計與篩選 利用探針設計軟件Beacon Designer 8 在序列兩端設計熒光探針和引物，并進行引物/探針正交組合，按照農業部2259 號公告－4－2015 標準規定的PCR 擴增產物大小為80～200 bp 的要求選出引物/探針組合[6]。

以1.2.1 提取的轉基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制10%的DNA 作為模板，采用通用實時熒光定量PCR 反應體系和反應程序[7]，根據結果選擇擴增信號最強和Ct 值最小的引物/探針組合作為定量檢測方法的候選引物。

1.2.3 反應體系優化 以1.2.1 提取的轉基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制10%的DNA 作為模板，探針濃度分別設置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，引物濃度為探針濃度的2倍，進行實時熒光定量PCR 擴增，根據Ct 值篩選最優組合。

1.2.4 特異性檢測 以1.2.1 提取的轉基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制1%DNA 作為陽性對照，受體玉米DNA 為陰性對照，采用其他轉基因作物混樣和非轉基因作物DNA進行特異性檢測。

1.2.5 雙標準曲線的建立 以1.2.1 提取的轉基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，稀釋成5 個不同含量的標準樣品(表2)，以優化后的反應體系及反應程序進行實時熒光PCR 反應，每個PCR 反應設置3 個平行。根據PCR 反應的Ct值和初始模板拷貝數的對數分別繪制MON87419和玉米內標準基因zSSIIb的標準曲線。

表2 耐除草劑玉米MON87419 轉化體檢測體系中的DNA 含量及拷貝數

1.2.6 正確度及精密度檢測 以1.2.1 提取的轉基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制5%、1%和0.1%的DNA 樣品，以1.2.3 優化后的反應體系及反應程序進行實時熒光PCR 反應。每個反應3 個平行，共進行3 次重復試驗，按照以下公式計算轉基因含量:MON87419 轉基因含量(%) ＝MON87419 拷貝數/zSSIIb拷貝數×100。計算多次測試的偏差(Bias)和相對標準偏差(RSD)。

1.2.7 定量限(LOQ)測定 目標濃度參考歐盟閾值0.9%，本方法將目標濃度設定為1%。根據農業部2259 號公告－5－2015 標準[8]規定轉基因檢測方法確定定量限不高于0.1%。

采用18 份轉基因玉米MON87419 含量為0.1%(PCR 反應體系中加入100 ng 模板)的DNA樣品進行定量測試。

1.3 數據處理與統計分析

采用SPSS 18.0 統計軟件計算平均值、變異率(CV)、標準差(SD)、相對標準偏差(RSD)及偏差(Bias)。

2 結果與分析

2.1 引物、探針設計與篩選

鑒于5′端GC 含量較低，僅在3′端設計出合適的引物與探針(表3)。

表3 耐除草劑玉米MON87419 轉化體實時熒光PCR 檢測候選引物和探針

將引物與探針正交組合12 對，連同孟山都提供的引物/探針(3′－13)共13 對(表4)，按照擴增信號最強和Ct 值最小的原則進行篩選。結果(圖1)表明，試驗設計的12 對引物/探針組合均獲得特異性擴增，其中3′－3、3′－6、3′－9 和3′－12 擴增Ct 值最小，擴增效果最好。按照探針設計原則，3′－9 和3′－12探針位置更接近上游，選擇3′－9 和3′－12 與孟山都提供的3′－13 進行下一步驗證。如圖2 所示，3′－13擴增曲線Ct 值更小，顯著優于其余引物/探針組合，故選用3′－13 作為候選引物/探針組合進行后續試驗，并命名為MON87419－QF/QR/QP。

表4 耐除草劑玉米MON87419 轉化體實時熒光PCR 檢測引物/探針組合

圖1 耐除草劑玉米MON87419 轉化體實時熒光PCR 引物探針的初步篩選

圖2 耐除草劑玉米MON87419 轉化體引物探針組合3′－9、3′－12 與3′－13 比較

2.2 反應體系優化

如圖3 所示，隨探針濃度的增加熒光擴增曲線上升幅度增加，Ct 值略有減少，當探針濃度為0.4 μmol/L 時，隨著濃度的增加Ct 值基本不變。綜合考慮擴增效率和體系配置的適用性等因素確定檢測引物濃度為0.8 μmol/L，探針濃度為0.4 μmol/L。

圖3 耐除草劑玉米MON87419 轉化體實時熒光PCR 引物探針反應濃度優化

2.3 特異性檢測

如圖4 所示，僅在耐除草劑轉基因玉米MON87419 中獲得擴增曲線，而在其他轉基因作物混樣和非轉基因作物中均未獲得擴增曲線，表明本方法篩選的引物/探針具有很好的特異性。

圖4 耐除草劑玉米MON87419 轉化體實時熒光PCR檢測方法特異性測試

2.4 標準曲線的建立

根據標準DNA 溶液PCR 反應的Ct 值及初始模板拷貝數的對數分別繪制MON87419 和zSSIIb的標準曲線(圖5)。結果表明，3 次平行試驗中MON87419 和zSSIIb檢測體系的Ct 值和模板拷貝數間均有良好的線性關系。

圖5 耐除草劑玉米MON87419 轉化體和玉米內標準基因zSSIIb 的標準曲線

2.5 正確度及精密度檢測

3 次重復測試結果顯示3 個濃度測試的偏差(Bias)、標準偏差(SD)和相對標準偏差(RSD)≤25%(表5)。說明MON87419 檢測方法的正確度與精密度均符合農業部2259 號公告－5－2015 的要求，具有較好的重復性。

表5 耐除草劑玉米MON87419 轉化體檢測方法的正確度和精密度測試

2.6 定量限(LOQ)的確定

如表6 所示，18 份轉基因玉米MON87419 含量為0.1%的DNA 樣品偏差和相對標準偏差均≤25%，由此確定本研究的定量限為0.1%。

表6 耐除草劑玉米MO87419 轉化體實時熒光PCR 方法定量限測試結果

3 討論與結論

伴隨著轉基因標識制度的實施和國家對轉基因作物安全監管力度的加強，轉基因作物的定量檢測已成為產業發展的必然要求。我國多側重于定性檢測轉基因作物方法的研究，如轉基因大豆MON87701、DP356043、CV－127 等定性檢測方法的建立，溫洪濤[9]、武文艷[10]等利用實時熒光定量技術分別建立了耐除草劑玉米G1105E－823C、抗蟲玉米2A－5 的定性檢測方法，Yang 等[11]以質粒為標準品建立了MON863、Bt11 等多個轉基因玉米定量檢測方法。但目前只有轉基因耐除草劑大豆GTS 40－3－2 和抗蟲水稻TT51－1 國家標準的定量檢測方法[12，13]， 未見轉基因玉米MON87419 定量檢測方法的相關研究。本研究以轉基因玉米MON87419 的DNA 為模板，定量準確性更高，應用范圍更廣。

目前國際認可的轉基因定量成分分析方法主要是實時熒光定量PCR 以及數字PCR。數字PCR 無需借助標準曲線即可實現絕對定量樣品的目的，國內外研究者[14－16]利用數字PCR 的方法研制出多個玉米轉化體的定量檢測方法，但數字PCR 作為一種新興技術，成本高，設備普及率較低，尚未建立相關的檢測標準。實時熒光PCR技術具有特異高效、穩定便捷等優點，現已廣泛用于轉化體的定量檢測[17－19]，但是需要依賴建立標準曲線進行樣品的絕對定量。隨著檢測技術的發展，建議逐步建立數字PCR 檢測的相關標準，實際檢測中可根據樣品情況靈活結合運用實時熒光PCR 與數字PCR，使新技術更好地服務于社會大眾。

本研究建立的實時熒光定量PCR 方法能夠準確定量模板DNA 的含量，具有良好的特異性、準確性和重復性。其定量限為0.1%，能夠滿足該轉化體的檢測需要，可為耐除草劑轉基因玉米MON87419 的定量檢測和有效監管提供新的技術手段和有力支撐。