牛病毒性腹瀉病毒片段可溶表達及抗體間接ELISA檢測方法的建立

張宇名，李樹凡，陳志遠，遲麗麗，劉健，于澤海，張玫瑜，康京麗，徐守振

(1. 青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109；2. 中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032)

目前現有的BVDV 診斷方法，如病毒分離、病毒中和、免疫瓊擴、免疫組化及核酸檢測等，或因通量低、工作量大，或因要求專業人員或相關精密儀器等原因，無法適應牧場高通量牛群篩選等工作，導致不能在牧場普及推廣。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)有著通量高、操作簡單快捷、靈敏性及特異性好等優點，被廣泛應用于牧場檢測和篩查BVDV。Erns(E0 或gP48)蛋白是BVDV 編碼蛋白中保守性較高的蛋白，存在中和表位，能刺激機體產生中和抗體[5]。Erns蛋白為組成BVDV 的囊膜糖蛋白之一，含有8 個可糖基化位點，可與細胞表面黏多糖特異性結合[6]。對Erns蛋白氨基酸序列的分析得知，Erns蛋白中含有一段保守性較高的結構區域[7]，Erns蛋白在診斷抗原領域具有重要意義。Deng 等[8]在2015年對我國BVDV 流行亞型的調查結果顯示，BVDV－1m 為我國主要流行亞型。本研究對BVDV－1m 亞型標準株Erns蛋白進行分析及優勢表位預測，利用大腸桿菌原核表達重組Erns截短蛋白，建立基于此蛋白的BVDV 抗體間接ELISA 檢測方法，以期為山東地區BVDV防控凈化及BVDV 臨床檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 樣品與載體

試驗所用待檢血清收集自山東地區規?；膛?，BVDV 抗體陰陽性牛血清均使用美國IDEXX 公司BVDV 抗體ELISA 檢測試劑盒(Ab99－44000)確認。牛傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBRV)抗體陽性牛血清、牛副結核(Map)抗體陽性牛血清、牛支原體(MB)抗體陽性牛血清均由本實驗室保存。pCold TF 載體購自北京華越洋生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

PEG 8000 及脫脂乳粉購自Sangon Biotech 公司；His－Tagged Protein Purification Kit(Soluble Protein)購自北京康為世紀生物科技有限公司；馬血清購自biosharp 公司；酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗牛HRP 標記抗體、TMB 單組份顯色液購自Solarbio 公司。

1.3 Erns蛋白抗原表位分析與截短片段選取

根據GenBank 中收錄的山東地區BVDV－1m亞型標準株SD－15(登錄號:KR866116.1)獲取Erns蛋白全長序列，并送至深圳華大基因股份有限公司進行質粒合成。使用DNAstar 軟件及IEDB庫對選取的Erns蛋白全長氨基酸序列進行分析，預測其抗原表位分布情況，并使用德泰在線抗原決定簇預測工具采用Kolaskar－Tongaonkar、Parker、Chou－Fasman、Karplus－Schulz、Emini 五種預測算法加以驗證，以選取抗原表位密集且親水性較好的Erns蛋白截短片段作為目的序列用于后續試驗。

1.4 重組載體構建及鑒定

根據選取的Erns片段序列使用Oligo 7 軟件進行引物設計，并分別在上下游引物插入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點(小寫字母處)。上游引物:5′－ccggaattcATGGATGCAAGTGAGAAGAC－ 3′，下游引物:5′－gctctagaATTCTTCCCCTTCTTACAGC－3′，送至Sangon Biotech 公司合成。以SD－15 Erns全長序列為模板，擴增Erns蛋白截短片段。擴增體系:上下游引物各1 μL，模板2 μL，2 ×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅠ(－dye)12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序:94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35 個循環；72℃10 min。片段與pCold TF 載體雙酶切后通過T4 DNA 連接酶進行連接。連接體系:pCold TF 純化片段2 μL，目的基因純化片段6 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，10×T4 Buffer 1 μL。連接完成后轉化DH5α 感受態細胞，轉化條件:冰浴解凍DH5α 感受態細胞后移入10 μL 重組質粒，冰浴30 min；42℃熱激轉化90 s，冰浴2 min；加入無抗性LB 液體培養基37℃慢速搖菌1 h 復蘇；3 000 r/min 低速離心6 min，重懸菌體涂布于Amp＋固體LB 培養基，置于37℃恒溫箱培養12～16 h，進行雙酶切及測序鑒定。

1.5 重組蛋白表達及純化

章學誠，字實齋，號少巖。浙江會稽(今紹興)人，生于清乾隆三年(1738)，卒于嘉慶六年(1801)，終年64歲。其生活的時代，正是歷史上所謂的“乾嘉時代”。

1.6 表達產物Western blot 及LC－MS/MS 鑒定

采用濕轉法進行Western blot 鑒定。100 V恒壓轉膜100 min；5% BSA 封閉液室溫封閉1 h；1∶2000 稀釋鼠源抗His 標簽一抗，4℃孵育過夜；1∶2000稀釋兔抗鼠HRP 標記抗體，室溫孵育1 h；按照上海碧云天生物技術有限公司BeyoECL Plus試劑盒說明進行顯色。為進一步鑒定目的蛋白的表達情況，取超聲破碎后菌體上清送至上海拜譜生物科技有限公司進行液相色譜串聯質譜LCMS/MS(1 h)鑒定。

1.7 間接ELISA 方法的優化

對純化后的Erns截短蛋白以常規間接ELISA方法作為基礎，采用單因素變量試驗，分別對影響間接ELISA 反應的各因素進行方陣優化:抗原包被濃度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL)；最佳封閉液(1% BSA、5% 脫脂乳粉、5%PEG 8000、1%酪蛋白、5%馬血清、10%馬血清)；一抗稀釋度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1 ∶640)；二抗稀釋度(1 ∶5000、1 ∶8000、1∶12000)；抗原包被時間(4℃過夜，37℃1 h 后4℃過夜，37℃2 h 后4℃過夜)；封閉時間(1.5、2.0、2.5、3.0 h)；一抗孵育時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)；二抗孵育時間(20、40、60、80、100、120 min)；顯色時間(10、15、20、25、30 min)。試驗均做3 次平行重復，并計算變異系數，以評估試驗可重復性。

1.8 間接ELISA 方法的陰陽性臨界值確定

取45 份經商品化ELISA 試劑盒檢測為BVDV 抗體陰性的牛血清，根據所測得OD450值結果計算臨界平均值及標準偏差S，根據陰陽性臨界判定規則(＋3S)確定間接ELISA方法的陰陽性臨界值。

1.9 間接ELISA 方法的特異性試驗

將優化后的ELISA 方法對BVDV 抗體陽性牛血清、IBRV 抗體陽性牛血清、Map 抗體陽性牛血清、MB 抗體陽性牛血清以及BVDV 抗體陰性牛血清進行同步檢測，以評估本ELISA 方法的特異性。試驗均做3 次平行重復，并計算變異系數。

1.10 間接ELISA 方法的敏感性試驗

將BVDV 抗體陽性牛血清按二倍比稀釋至1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560 倍，使用優化后的ELISA 方法進行檢測，以評估本ELISA 方法的敏感性。試驗均做3 次平行重復，并計算變異系數。

1.11 間接ELISA 方法臨床樣品試驗

應用本ELISA 方法與IDEXX 公司BVDV 抗體ELISA 檢測試劑盒同時檢測92 份臨床牛血清樣品，比較檢測結果，計算陰陽性符合率。

2 結果與分析

2.1 Erns蛋白抗原表位預測與截短片段的選取

使用DNAstar 軟件對BVDV Erns蛋白全長氨基酸序列的正電荷分布、無規卷曲、親水區、表面可及性及抗原表位區域進行預測，結果見圖1A；IEDB 在線數據庫預測抗原表位結果見圖1B；德泰在線抗原決定簇預測結果見圖1C。綜合多種預測結果，本研究選取Erns蛋白中親水性較強、抗原指數高、表面可及性較好的60 ～ 145 aa 區域()作為后續間接ELISA 方法的包被抗原。

2.2 重組載體構建與鑒定結果

圖2 片段PCR 擴增結果

圖3 pCold TF－雙酶切結果

2.3 重組蛋白表達及純化結果

SDS－PAGE 結果顯示，超聲后菌體上清成功可溶表達出片段，大小為73.86 kDa，與預期大小相符(圖4)。純化后結果顯示，非目的蛋白數量明顯減少，在300 mmol/L 咪唑濃度時收集到最大洗脫峰(圖5)。

圖4 蛋白表達結果

圖5 蛋白純化結果

2.4 表達產物Western blot 及LC－MS/MS 鑒定結果

圖6 蛋白Western blot 結果

圖7 蛋白LC－MS/MS 鑒定結果

2.5 間接ELISA 方法的方陣優化結果

2.5.1 抗原包被濃度優化 結果顯示，抗原包被濃度為0.25 μg/mL 時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表1)。

表1 抗原包被濃度優化

2.5.2 最佳封閉液選擇 結果顯示，封閉液為10%馬血清時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表2)。

表2 最佳封閉液選擇

2.5.3 一抗稀釋度優化 結果顯示，一抗稀釋度為1 ∶5 時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表3)。

表3 一抗稀釋度優化

2.5.4 二抗稀釋度優化 結果顯示，二抗稀釋度為1∶8000 倍時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表4)。

表4 二抗稀釋度優化

2.5.5 抗原包被時間優化 結果顯示，包被時間為37℃2 h 后4℃過夜時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表5)。

表5 抗原包被時間優化

2.5.6 封閉時間優化 結果顯示，封閉時間為1.5 h時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表6)。

表6 封閉時間優化

2.5.7 一抗孵育時間優化 結果顯示，一抗孵育時間為2.5 h 時，陰陽性P/N 值最大，為5.169，但孵育時間為1.5 h 時，P/N 值為5.013，二者相差不大，不存在顯著性差異(P＝0.400)。本著節省時間原則，選用孵育1.5 h，其變異系數低于15%，重復性良好(表7)。

表7 一抗孵育時間優化

2.5.8 二抗孵育時間優化 結果顯示，二抗孵育時間為60 min 時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表8)。

表8 二抗孵育時間優化

2.5.9 顯色時間優化 結果顯示，顯色時間為25 min 時，陰陽性P/N 值最大，變異系數低于15%，重復性良好(表9)。

表9 顯色時間優化

經過方陣優化后最終條件為:0.25 μg/mL 抗原包被37℃2 h 后4℃過夜，10%馬血清封閉時間1.5 h，1∶5 稀釋一抗孵育1.5 h，1∶8000 稀釋二抗孵育60 min，顯色25 min。

2.6 間接ELISA 方法陰陽性臨界值確定結果

使用優化后的條件，對45 份BVDV 抗體陰性牛血清OD450值進行檢測(表10)，測得OD450平均值為0.301，標準偏差S 為0.049。根據陰陽性臨界判定規則確定本ELISA 方法的陰陽性臨界值為0.448，即樣品OD450值≥0.448 時判定為陽性，樣品OD450值<0.448 時判定為陰性。

表10 45 份BVDV 抗體陰性牛血清OD450值

2.7 間接ELISA 方法特異性試驗結果

特異性試驗結果(表11)顯示，僅BVDV 抗體陽性牛血清OD450值大于0.448，其他均為陰性，表明本間接ELISA 方法具有良好的特異性，且變異系數低于15%，重復性良好。

表11 間接ELISA 特異性試驗結果

2.8 間接ELISA 方法敏感性試驗結果

敏感性試驗結果顯示，當陽性血清稀釋1 280 倍時，OD450值仍大于0.448，表明本方法具有良好的敏感性，且變異系數低于15%，重復性良好(表12)。

表12 間接ELISA 敏感性試驗結果

2.9 間接ELISA 方法臨床樣品試驗結果

使用間接ELISA 方法與IDEXX 公司BVDV抗體ELISA 檢測試劑盒同時檢測92 份臨床牛血清樣品，并對檢測結果進行統計學分析，結果(表13)顯示，兩者陽性符合率為86.15%，陰性符合率為92.59%，總體符合率為88.04%。

表13 臨床樣品試驗結果

3 討論與結論

BVDV 臨床發病率高、癥狀復雜、可跨物種傳播，給整個畜牧行業帶來嚴重安全隱患[9]。懷孕早期的母牛一旦感染，常通過胎盤使胎兒產生免疫抑制[10]，如果小牛正常產出，一出生便為持續感染(persistent infection，PI)牛。PI 牛體內始終帶毒且持續排毒、無臨床癥狀、血清中又無保護性抗體，是牛群中決定性傳染源，由此造成的經濟損失巨大。歐洲、澳大利亞、新西蘭等國家均通過淘汰牛群中的PI 牛和全群免疫，有效地控制了BVD－MD[11.12]。BVD－MD 的篩選與凈化對養牛業健康發展影響重大，對牛群進行BVDV 抗體篩查不僅可以追蹤牛群近期感染BVDV 的情況，判定牛只感染狀態，也能作為篩選和凈化PI 牛的輔助手段[13－15]。因為PI 牛不能產生中和抗體，因此進行牛群BVDV 抗體篩選，可以縮小PI 牛篩查范圍，提高效率。對于BVDV 抗體篩查，當前常用的方式包括中和試驗及間接ELISA 試驗，相較于中和試驗，間接ELISA 方法更方便快捷、適用于大規模檢測，故臨床中多采用間接ELISA 方法。BVDV 國際標準ELISA 檢測試劑盒長期由國外公司壟斷、價格昂貴、獲取困難，因此國產試劑盒研制與應用刻不容緩。

BVDV－1m 為近年來我國主要流行亞型[8]，且前期研究針對2019—2021年山東地區規模化奶牛場BVDV 亞型遺傳進化分析的結果亦顯示BVDV－1m 為近年來山東地區規?；膛鰞瀯萘餍衼喰?，故本ELISA 方法選用山東地區BVDV－1m 亞型標準株作為包被抗原序列來源。BVDV在我國存在眾多流行亞型，單獨選擇某種BVDV亞型蛋白進行表達難免有失偏頗，為兼顧其他BVDV 亞型存在及流行的客觀現狀，本研究選取BVDV 多聚蛋白中在各亞型間保守性較好的Erns蛋白作為ELISA 方法的包被抗原。通過原核表達BVDV Erns蛋白全長，表達產物多以包涵體形式存在[16－18]。本試驗前期嘗試過直接使用BVDV Erns蛋白全長進行原核表達，表達產物存在于包涵體中，與上述結果相符。之前研究通過使用鹽酸胍變性復性法嘗試進行包涵體處理，通過先將包涵體蛋白變性溶解在變性緩沖液中，再緩慢滴加至復性緩沖液中進行復性，最終通過透析手段去除相關試劑殘留，得到的復性BVDV Erns蛋白濃度低(0.386 mg/mL)，蛋白損失極大，使用該蛋白作為包被抗原進行間接ELISA 方法預試驗，結果顯示陰陽性差值過小，復性率很低。因此本研究對BVDV Erns蛋白進行親水性預測和抗原表位分析，選定作為間接ELISA 方法的包被抗原，表達量高于Erns蛋白全長，且為可溶性表達，在試驗中表現良好；通過Western blot 及LC－MS/MS 鑒定顯示，所選蛋白表達正確，具有良好的抗原性，故最終選定蛋白作為間接ELISA方法的包被抗原。本方法包被蛋白濃度僅需0.25 μg/mL 便可進行，用量少，成本低；選用10%馬血清作為封閉液，相比固態封閉液(需稱量、溶解)配置更為方便、準確；酶標二抗稀釋度為1∶8000，成本可控；抗原包被后，隔天檢測用時可控制在6 h 之內；能夠正確區分牛群常見病原IBRV、Map、MB，特異性良好；可以檢測到最低稀釋至1 280倍的BVDV 抗體陽性牛血清，靈敏性良好；在整個ELISA 方陣優化及后續特異性、敏感性試驗中持續進行重復性試驗，變異系數一直控制在15%以內，重復性良好；與IDEXX 公司BVDV 抗體檢測試劑盒平行檢測試驗中，兩者陽性符合率為86.15%，陰性符合率為92.59%，總體符合率為88.04%，符合率良好。ELISA 方法建立過程中，考慮到若不使用相關蛋白保護成分而直接包被蛋白后保存進行定期批間重復試驗會導致蛋白降解，影響陰陽性臨界值的標定和結果讀取，故本方法未設置批間重復試驗，只進行批內重復試驗，以保證結果讀取的準確性。如后續有對保存時間的需求，應進一步對相關蛋白保護劑進行研究。本方法嘗試使用10%無菌甘油作為蛋白凍存保護劑，效果良好，能夠保護蛋白在反復凍融過程過度降解，也可采用蛋白分裝保存的方式避免反復凍融。

進行牛群BVDV 凈化及篩選淘汰PI 牛，利于降低牛群BVDV 整體發病率，也利于保護奶牛養殖業健康有序發展。山東地區作為我國東部地區重要的奶牛規模化養殖省份，近年來BVDV 流行情況較為嚴重，建立一種適應于當前山東地區乃至全國規?；膛鯞VDV 優勢流行亞型的檢測方法作為技術儲備，具有較強的現實意義。