混菌發酵對口含煙原料提質降害研究

楊 靜，李書貴

(1.貴州省煙草公司黔東南州公司，貴州凱里 556000；2.黔東南州煙草公司施秉縣分公司，貴州施秉 562000)

煙葉中煙堿(nicotine)的含量占總植物堿含量的95%以上，是影響煙葉品質的特征性指標之一[1]。煙堿的含量與煙民的健康密切相關，含量過高可能會對身體健康產生嚴重危害[2]。近年來，隨著國內外控煙形勢的日益嚴峻，口含煙成為煙草工業企業的重要研究方向之一?？诤瑹煯a品質量安全監控的重要指標之一就是煙堿的釋放量[3]，同時煙堿對味覺具有很重要的影響，尤其在口含煙中，游離煙堿直接透過口腔黏膜被人體吸收，刺激人腦多巴胺的產生，從而增加人的滿足感[4]。在煙葉中煙堿含量偏高，導致放入口中使用時刺激性、辛辣味較重，煙堿含量的降低有利于降低煙草原料的辛辣感，從而改善口含煙的刺激感。有學者利用煙草土壤為試驗材料，從中篩選提取一株有效降解煙堿的微生物，并且進行了鑒定、確定其最佳生長條件及其降解煙堿最大的發酵條件，其降解率能達到82%[4-7]。也有學者研究發現，微生物對煙葉化學成分和評吸品質有一定的影響，能夠降低煙葉煙堿含量，對提高香氣量、改善香氣質有很好的作用[2，8-11]。現代發酵工業中，純種發酵占很大的比例[12]。但在長期的試驗和生產實踐中，人們不斷地發現很多重要生化過程僅靠單株微生物不能完成或只能微弱地進行，必須依靠2種或多種微生物共同培養來完成，即混菌培養或稱為混菌發酵?；炀l酵是采用2種或多種微生物的協同作用共同完成某發酵過程的一種新型發酵技術，是純種發酵技術的新發展，也是一種不需要進行復雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發酵技術。目前很多研究表明混合菌種發酵的產品品質明顯強于單一菌種發酵[13-19]。該研究通過以解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01復合菌進行口含煙煙草原料發酵試驗，通過控制菌種比、接種量、有糖鹽溶液添加量，以發酵后煙堿含量為指標，優化發酵工藝，并對發酵后煙草原料進行感官品評，從嗅香、滿足感、口感特征、異味、口腔余香5個方面對發酵后煙草原料進行一個比較全面的評價，綜合評價混菌發酵口含煙煙草原料的煙堿含量及感官品質。

1 材料與方法

1.1 供試材料解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01來自貴州大學釀酒與食品工程學院實驗室保藏菌株。口含煙煙草原料選用貴州省黔東南州煙區生產的云煙87上、中部葉片(B2F、C3F)。將葉片用水清洗掉表面的灰塵和雜質后分別放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干，粉碎密封保存。

1.2 菌株培養種子培養液：胰蛋白胨 0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖 0.25 g、蒸餾水400 mL，加熱溶解，均等裝入小錐形瓶各20 mL，于121 ℃、20 min滅菌，取出冷卻。冷卻后，將培養好的菌株(在無菌操作臺中)分別加至小錐形瓶中，每瓶一株菌(液體保藏菌接2 mL)，蓋好，寫上標簽，放入搖床中37 ℃培養12 h，用于第2天接菌進入煙葉。

1.3 煙葉發酵工藝

1.3.1制備種子液。準確稱取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g，加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后接入菌種，180 r/min 37 ℃進行培養18 h，最終得到植物乳桿菌SQ-4種子液活菌濃度為9.52 CFU/mL、解淀粉芽孢桿菌GUHP86種子液活菌濃度為9.58 CFU/mL、枯草芽孢桿菌B01種子液活菌濃度為9.56 CFU/mL。

1.3.2煙草原料發酵工藝。圖1為煙葉的發酵工藝。用水將煙葉表面的灰塵和雜質清洗后放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干，打磨成粉，稱取20 g裝入14 cm×10 cm的無菌密封袋，滅菌備用。在無菌操作臺中將培養好的菌株分別放入均等的大離心管中，于8 000 r/min離心10 min。離心以后，傾倒出上清液，保留菌體，用已滅菌的生理鹽水20 mL加至此離心管中，搖勻。吸取適量離心管內菌液于裝有已滅菌的煙粉塑封袋內，適量加入鹽溶液，充分混勻，貼上標簽放入恒溫培養箱內進行發酵，每天需進行換氣。取樣時將煙粉在120 ℃滅菌20 min后冷凍保藏[20]。

圖1 煙葉的發酵工藝

1.4 單因素試驗

1.4.1不同菌種比接種發酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區生產的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發酵煙草原料20 g，按1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1比例添加混合菌種6 mL，空白試驗不添加微生物添加4 mL有糖鹽溶液，每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL，在37 ℃下發酵15 d，將發酵后煙粉在 115 ℃下滅菌 20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區生產的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發酵煙草原料20 g，按解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種，接菌量按3、4、5、6、7 mL添加，空白試驗不添加菌種添加4 mL有糖鹽溶液，每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL，在37 ℃下發酵15 d，將發酵后煙粉在115 ℃下滅菌20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區生產的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發酵煙草原料20 g，按3、4、5、6、7 mL添加有糖鹽溶液，添加解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1混合菌種6 mL，空白試驗不添加有糖鹽溶液加入蒸餾水，在37 ℃下發酵15 d，將發酵后煙粉在115 ℃下滅菌 20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.4煙堿含量的測定方法。參照煙草行業推薦標準YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動(硫氰酸鉀)法》[21]進行煙堿含量測定。

1.5 正交試驗在單因素試驗的基礎上，選取菌種比、接種量和有糖溶液添加量作為因素進行L9(34)正交試驗，優化口含煙混菌發酵工藝。

1.6 數據分析與處理試驗數據采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析，結果以平均值±標準偏差表示，n=3。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1不同菌種比接種發酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。由圖2可知，按照“1.4.1”的方法及條件進行試驗，添加菌種能夠明顯降低口含煙煙草原料中煙堿含量，當解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發酵時，煙堿含量最低(1.52%)，煙堿降解率最高(45.91%)，相對單菌發酵有所提高。同時當解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發酵時，其感官評分最高，為92分，其綜合口感和香氣比較和諧(表1)。

表1 不同菌種比條件下感官評定結果

圖2 不同菌種比對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.1.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。試驗結果表明(圖3和表2)，接菌量對發酵后煙堿的降解率、原料的感官評價是有影響的，隨著接菌量的增加，發酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低，當接菌量為6 mL時，發酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.50%)，煙堿降解率最高(47.37%)，相對單菌發酵有所提高；當接菌量超過6 mL 時煙堿降解率降低。同時從表2可以看出，當接種量為6 mL時，其感官評分最高，為93分，嗅香、口腔余味提升。

表2 不同接菌量條件下感官評定結果

圖3 不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.1.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。從圖4可以看出，隨著有糖鹽溶液添加量的增加，發酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低，當有糖鹽溶液添加量為4 mL時，發酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.46%)，煙堿降解率最高(45.52%)，相對單菌發酵有所提高；當有糖鹽溶液添加量高于4 mL時煙堿降解率降低。當有糖鹽溶液添加量為4 mL時，其感官評分最高，為93分(表3)。

表3 不同有糖鹽溶液添加量條件下感官評定結果

圖4 有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.2 正交試驗根據單因素試驗結果，選取對口含煙煙草原料煙堿含量影響較大的 3 個因素，分別為菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量，采用 L9(34)正交進行試驗設計。正交試驗因素與水平見表4，正交試驗結果見表5。

表4 正交試驗因素和水平

從表5可以看出，各因素對口含煙煙草原料混菌發酵降煙堿的影響程度不同，對煙草原料發酵感官評價影響也不同，從R值可以得出其影響順序均為A>B>C，即菌種比的影響最大，其次是接菌量，有糖鹽溶液添加量影響最小。從煙堿含量及感官評分得出最佳提取條件為A3B3C1，而根據k值分析得出的最佳提取條件組合為A3B2C1，因此要對這2個組合進行3組平行對比試驗，試驗結果如表6所示。通過驗證試驗對比，組合A3B2C1比組合A3B3C1發酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好，感官評分更高，所以可以確定最優組合為A3B2C1，當解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發酵，接菌量為6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 時，發酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好，感官評價更優。

表5 正交試驗結果

表6 驗證試驗對比

3 小結

煙堿是煙草最重要的化學成分之一，煙堿含量過高會影響口含煙產品的品質，該研究采用解淀粉芽孢桿菌GUHP86與枯草芽孢桿菌B01對口含煙煙草原料進行混菌發酵，以發酵后煙堿含量和感官評分為指標，通過監測發酵過程中煙草原料中煙堿含量變化和感官評分確定混菌發酵的條件。結果表明，經過混菌發酵后，口含煙煙草原料中煙堿含量在不同的菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量條件下均發生了明顯的變化，在解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1、接種量為 6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 的條件下，37 ℃ 發酵15 d，口含煙煙草原料中煙堿含量達到最低值(1.53%)，發酵后口含煙煙草原料感官評分達到最高(94分)。這可能是發酵產生了一定活力的酶如蛋白酶，將煙葉中蛋白質分解為一些具有特殊風味的氨基酸參與微生物代謝，因此在感官上，加菌發酵煙葉較自然發酵煙葉整體更為協調，香味復雜濃烈，勁頭足，刺激性小，滋味更豐富[22]。通過試驗發現，混菌發酵可以提高煙草中煙堿的降解率，降低煙葉有害物質，提升煙葉質量，提高食用舒適性，使煙葉整體香味更為諧調，為煙葉的混菌發酵技術開發提供一定的理論和技術參考。