基于RAPD分子標記的黑麥草遺傳多樣性分析

苗貴東，吳小梅，楊慧連，牛秋芳

(1.興義民族師范學院民族藥用生物資源研究與開發重點實驗室,貴州興義 562400;2.貴州省化學合成及環境污染控制和修復技術特色重點實驗室,貴州興義 562400;3.興義民族師范學院生物與化學學院，貴州興義 562400)

黑麥草(LoliumperenneL.)(2n=2x=14)是被子植物門單子葉植物綱禾本科黑麥草屬(Lolium)植物[1]。黑麥草種子狹長，4～6 mm,成熟后易脫落，千粒重1.5 g[2]。黑麥草的營養價值較高，營養成分富含蛋白質、礦物質和維生素，其中粗蛋白含量較為豐富，品質優良，適口性好，因此為多種家畜所喜食，消化率70%左右[3]。由于其優良的飼草性，因此篩選優質牧草品種對于山地資源利用和精準扶貧有極大的推動作用，具有重要的實際應用價值。

RAPD (random amplified polymorphic DNA)，即隨機擴增多態性DNA標記,RAPD是建立在PCR (polymerase chain reaction)基礎之上的一種可對整個未知序列基因組進行多態性分析的分子技術,是由美國的Williams等[4]和加利福尼亞研究所Welsh等[5]領導的2個研究小組于1990年同時提出的。目前該技術已大量應用于系譜分析及進化關系等方面的研究。目前該標記技術還應用于多年生黑麥草的遺傳多樣性和品種資源研究[6-7]。RAPD分子以一些人工合成的不同隨機寡核苷酸序列(10 bp) 作為引物，對所研究的基因組DNA(模板DNA)在Taq聚合酶的催化下，以dNTP作為原料進行PCR酶促體外擴增反應，從而產生不連續的DNA產物，擴增的產物可以通過聚丙烯酞胺凝膠或者瓊脂凝膠電泳分離和溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下可檢測擴增DNA片段的多態性。RAPD標記的特點為標記數量多，可以覆蓋基因組中所有位點；引物通用，成本低；操作簡單；使用的模板DNA量極少；操作安全，試劑毒性小等[8]。筆者運用RAPD標記技術對黔西南引種的黑麥草群體開展群體遺傳多樣性分析，通過篩選RAPD標記引物、PCR體系優化及群體擴增，評價引種群體遺傳多樣性，旨在為開展群體選擇及種質資源評價研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況試驗用地塊設在貴州省興義市頂效鎮興義民族師范學院試驗基地，坐落于貴州省西南部，地處105°36′E，25°12′N，海拔1 270～1 480 m,具有亞熱帶季風氣候特征，干旱，日照長，無霜期300 d左右，年均氣溫14～19 ℃。雨熱同季，降水量在1 300～1 600 mm。試驗地屬于沙質土，土壤貧瘠。

1.2 試驗材料所選取的黑麥草品種來源于江蘇省，選取均勻一致、品質良好的黑麥草種子。在試驗基地進行黑麥草種植，到可收割期后，按照隨機選取方法隨機選取24株樣本，組成試驗群體。

1.3 黑麥草種植選用優質黑麥草種子，綜合參照文獻的方法[9-13]，確定種植時間及播種方法[14]。2018年12月26日黑麥草高度35～68 cm時收割，采用隨機采樣法采集24個樣本植株，分別放入24個采樣袋中并依次標記1～24個序號，采集完畢后將樣本材料放到-80 ℃冰箱中冷凍保存備用，黑麥草收割后的留茬高度約為5 cm，并追肥尿素，澆水灌溉，待其生長高度達到可收割的高度時即可進行再次收割。

1.4 試驗方法對通過PCR擴增的群體試驗結果采用群體遺傳的分析方法進行遺傳多樣性分析及群體聚類分析。

2 結果與分析

2.1 黑麥草基因組DNA的提取及檢測經過查閱相關文獻[15-18]，提取黑麥草24個嫩葉中的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測得到基因組DNA(圖1)。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 黑麥草個體DNA

2.2 RAPD引物篩選經過多次PCR條件優化與引物PCR擴增篩選，35條RAPD引物中，最終有6個引物獲得較好擴增(C13、C02、D16、E03、A18、B05)。將這些引物用于后續群體擴增，在由24個個體組成的黑麥草群體中，6個引物擴增獲得的清晰可統計的RAPD擴增條帶共52條，部分引物擴增產物通過瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統成像的結果見圖2。

注：M.DL 2000 Marker

2.3 RAPD-PCR反應體系優化試驗材料為黑麥草DNA，選取51條RAPD引物進行篩選，依據文獻[19-22]，體系中10×buffer含量為2.5 μL，DNA模板為2.0 μL固定不變，對6個因子(dNTP、MgCl2、Taq酶、引物濃度、退火溫度和反應循環數)均設置不同濃度梯度(表1)。

表1 RAPD-PCR反應體系優化的各成分及濃度梯度

2.3.1最佳Mg2+濃度的確定。Mg2+濃度直接影響酶活性，從圖3可見，Mg2+濃度大于2.6 mmol/L或低于2.6 mmol/L時，條帶彌散。因此，選擇2.6 mmol/L Mg2+為最佳反應水平。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～6. Mg2+濃度2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 mmol/L

2.3.2最佳dNTP濃度的確定。dNTP是PCR反應的原料之一，其量不能過多也不能過少，過少會使反應不充分，而過多則會抑制Mg2+，最終影響聚合酶的活力。從圖4可見，0.55 mmol/L為最佳dNTP濃度。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 mmol/L dNTP

2.3.3最佳Taq酶濃度的確定。Taq酶的活性以及用量對擴增的結果影響很大，用量過少，則擴增出的條帶少或無擴增；用量過多，則擴增出的條帶彌散或者非特異性條帶增多。從圖5可見，Taq酶的用量以0.20 U效果最好。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～8. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 U Taq酶

2.3.4最佳引物濃度的確定。從圖6可見，經過多次分析和比較，引物濃度在0.40 mmol/L時條帶清晰且非特異性條帶極少。因此，最佳引物濃度為0.40 mmol/L。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～9. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mmol/L

2.3.5最佳退火溫度的確定。退火溫度過低或者過高均會引起非特異性擴增的增多。從圖7可見，最終確定35 ℃為最佳退火溫度。

注：M:DL 2000 Marker；泳道1～8. 32、33、34、35、36、37、38、39 ℃

2.3.6最佳循環次數的確定。從圖8可以看出，40次循環次數產生的帶型最好，因此40次循環為最佳循環。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～7. 25、30、35、40、45、50、55個循環

2.3.7最優反應體系的確立。優化后的PCR總反應體系10×Buffer 2.50 μL，MgCl22.60 μL，dNTP 1.375 μL，DNA模板 2.00 μL，Primer 0.750 μL，Taq酶 0.750 μL，ddH2O 15.025 μL，總計25 μL。RAPD-PCR反應程序見表2。

表2 PCR反應程序

2.4 多樣性分析黑麥草RAPD引物在群體中擴增后經過瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統得到的部分結果見圖9。多態位點比率是指具有多態性的位點數占檢測到的位點數的比例，它是可以衡量一個種群內遺傳變異水平高低的重要指標，可用于分析黑麥草種內之間遺傳變異率，針對多態性的分析結果見表3。由表3可知，6個引物共擴增出52條，其中具有多態性的條帶有49條，無多態性的條帶有3條，多態性條帶比率(PPB)為94.23%，這表明供試黑麥草群體的多態性高。

表3 引物序列與擴增結果

注：M.DL 2000 Marker

2.5 遺傳多樣性分析將篩選出的6個引物擴增條帶按照從小片段到大片段依次進行統計，有條帶的記1，沒有條帶的記0。統計好的數據通過NTsys軟件進行相似系數的計算和聚類分析，結果見圖10。試驗結果分析表明，引種黑麥草個體間遺傳差異較大，引種品種種群遺傳差異具備一定遺傳可選性。由聚類分析結果可以看出，24個個體聚為5個分支，遺傳差異較大，因此群體具有較高的遺傳多樣性，種群多樣性可為開展物種群組選育研究奠定基礎。

圖10 黑麥草24個個體的聚類分析樹狀圖

3 結論

通過PCR條件優化，其中RAPD引物最終獲得的最優反應條件為：Mg2+濃度2.6 mmol/L,dNTP濃度為0.55 mmol/L，引物濃度為0.4 mmol/L,Taq酶濃度為0.20 U，最佳退火溫度35 ℃，最佳循環數為40個，最適模板含量約為100 ng DNA。

對24個黑麥草個體進行了遺傳多樣性分析，共篩選出6個效果較好的引物可用于PCR擴增，總共獲得RAPD標記譜帶52條，其中有多態性條帶49條，多態性條帶百分率為94.23%，其多態性較高。引種黑麥草的遺傳差異較大，對貴州省黔西南州地區的環境適應性較高，具備一定的可選育性。種群多樣性為開展品種群組選育和遺傳選育研究奠定重要的遺傳學基礎，也為培育符合地方需求的品系奠定基礎。