高效液相色譜法測(cè)定疏風(fēng)清熱合劑中黃芩苷的含量

王珂逸

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科,湖南 長沙 410005)

黃芩為常用中藥,性寒味苦,具有消炎去暑、敗火清涼的作用,又稱山茶根、黃金茶,臨床多用于解毒瀉火、除熱安胎、涼血止血、清熱祛濕,黃芩苷則是從黃芩根部提取分離,生物學(xué)活性顯著,具有抗炎利尿、解痙抑菌的效果,近年來研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷可用于抗癌、抑制黑色素生成[1]。中藥制劑疏風(fēng)清熱合劑中黃芩為主藥,但制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)黃芩苷含量測(cè)定進(jìn)行單獨(dú)列相,對(duì)黃芩苷含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定有利于更好的控制疏風(fēng)清熱合劑的制劑質(zhì)量。目前用于測(cè)定黃芩苷的方法包括導(dǎo)數(shù)光譜法、分光光度法、薄層掃描法和HPLC法[2],其中HPLC法測(cè)定黃芩苷含量時(shí)通常以紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定,簡單可靠且重現(xiàn)性良好,能縮小結(jié)果與真實(shí)含量的誤差。本研究的目的在于尋求疏風(fēng)清熱合劑制劑過程中黃芩苷質(zhì)量控制方法,采取HPLC測(cè)定合劑中黃芩苷含量,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

①KQ系列硬式內(nèi)鏡數(shù)控超聲波清洗器;②高效液相色譜儀(德國安捷倫Agilent 1260高效液相色譜儀),由四元梯度泵、紫外線檢測(cè)器、柱溫箱、CS-Light Potrun Anglysis色譜工作站組成;③分析型動(dòng)態(tài)混合器、手動(dòng)進(jìn)樣閥;⑤柱溫箱(博納艾杰爾CC-100分析型);⑥自制混合型烷基鍵合硅膠色譜柱;⑧電子分析天平。

1.2 試劑

①疏風(fēng)清熱合劑由本院制劑室自制;②重蒸餾水;③液相色譜專用甲醇,以磷酸為分析純;④黃芩苷對(duì)照品(成都貝斯特,CAS號(hào):21967-41-9,20mg/支)。

1.3 測(cè)定方法

①色譜條件。C18柱(5μm,4.6mm×250mm),柱溫30℃,波長280nm,敏感性0.01AVFS,進(jìn)樣量為20μg/次,流動(dòng)相為甲醇——水——磷酸,配比為47∶53∶0.2,流速控制在1mL/min,以黃芩苷峰計(jì)為理論板數(shù),需≥2500。

②制備流動(dòng)相。流動(dòng)相A:測(cè)定前將甲醇超聲30mi后冷卻。流動(dòng)相B:精密量取2.0mL磷酸,以重蒸餾水稀釋至500mL后搖勻,獲得0.2%磷酸水溶液,以G4砂芯漏斗過濾磷酸水溶液,超聲30min后冷卻待用。

③制備對(duì)照品溶液。在60℃溫箱中將黃芩苷對(duì)照組減壓干燥4h后精密稱取21.26mg,并置入100mL容量瓶,加入甲醇溶液稀釋至刻度,超聲20min后冷卻,再次加入甲醇溶液補(bǔ)足刻度,搖勻后待用。

④制備樣品溶液。精密量取2.0mL疏風(fēng)清熱合劑至50mL容量瓶中,加入甲醇溶液稀釋至刻度,超聲溶解20min后冷卻,搖勻后以微孔濾過膜過濾,濾液即樣品溶液。

⑤制備陰性對(duì)照液。另取疏風(fēng)清熱合劑處方中除黃芩外的其他藥材,按處方工藝制備不含黃芩的試劑,參照樣品溶液制備方法獲取陰性對(duì)照液。

⑥系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性對(duì)照液20μL注入高效液相色譜儀,對(duì)照品保留時(shí)間16.525min,柱效11274.4,樣品保留時(shí)間16.590min,柱效10769.1,陰性對(duì)照液保留時(shí)間15.754min,柱效11509.7,觀察色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖分析

對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照液在色譜條件下保留時(shí)間約4.1min處時(shí),對(duì)照品和樣品溶液有色譜峰出現(xiàn),理論塔板數(shù)≥6000,陰性的對(duì)照液無色譜峰出現(xiàn),說明黃芩苷在HPLC法測(cè)定條件下不受雜質(zhì)峰干擾。

2.2 線性關(guān)系

分別精密量取0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL黃芩苷對(duì)照液置入5mL量瓶中,以1∶1的甲醇—水稀釋至刻度,搖勻后經(jīng)0.45μm微孔濾膜法過濾,分別精確進(jìn)樣20μL,檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷線形關(guān)系分析結(jié)果

將對(duì)照品溶液濃度(C)設(shè)為橫坐標(biāo),將其色譜峰面積(A)設(shè)為縱坐標(biāo),得出黃芩苷對(duì)照品溶液線性回歸方程為A=-2.5023+0.468C,r=0.878,標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示在8.40～211.51μg/mL的范圍內(nèi)黃芩苷有良好的線性關(guān)系。

2.3 測(cè)定限值

將黃芩苷以50%甲醇溶解,配制成8.5μg/mL的濃度,在20μL精確進(jìn)樣,以信噪比3∶1計(jì)算可得黃芩苷最小檢測(cè)量為0.05μg/mL。

2.4 樣品溶液黃芩苷含量測(cè)定

分別取本院制劑室提供的三個(gè)不同批次疏風(fēng)清熱合劑,按“1.3”方法制備樣品溶液和對(duì)照品溶液,分別精確取樣20μL,在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以線性回歸方程計(jì)算黃芩苷含量,見表2。

表2 樣品溶液黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.5 回收率

取批號(hào)20210809含量為10.851mg/mL的樣品溶液6份,每份精確量取1.0mL置入10mL容量瓶中,精確量取含量0.099mg/mL的對(duì)照品溶液2.0mL、3.0mL、5.0mL各2份,以甲醇——水溶液稀釋至刻度后搖勻,經(jīng)0.45μm微孔濾膜法過濾后取續(xù)濾液,按“1.3”色譜條件測(cè)定,結(jié)果顯示平均回收率為99.13%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.87%。見表3。

表2 樣品溶液黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.6 重復(fù)性

取批號(hào)20210809樣品溶液,按“1.3”方法平行制備6份溶液,在色譜條件下分別進(jìn)樣6次,每次20μL,對(duì)色譜峰面積進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示黃芩苷平均色譜峰面積為56.508,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.56%,重現(xiàn)性良好。

2.7 精密度

取線性關(guān)系下對(duì)照品溶液0.8mL,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次20μL,結(jié)果顯示黃芩苷平均色譜峰面積29.382,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.55%,儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性

①日內(nèi)穩(wěn)定性。取批號(hào)20210809樣品溶液,制備后室溫下放置,分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h時(shí)測(cè)定黃芩苷色譜峰面積,結(jié)果顯示平均色譜峰面積為47.637,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.86%,說明12h內(nèi)可進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

②日間穩(wěn)定性。取批號(hào)20210809樣品溶液,制備后室溫下放置,分別在0d、1d、3d、6d、10d、15d時(shí)測(cè)定黃芩苷色譜峰面積,結(jié)果顯示平均色譜峰面積為46.515,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差1.08%,說明樣品溶液15d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

中藥制劑在我國中醫(yī)藥學(xué)中占有重要地位,是基于傳統(tǒng)湯、丸、丹、膏、散等經(jīng)典劑型而發(fā)展到現(xiàn)代多個(gè)劑型和品種,對(duì)臨床慢性疾病的防治有重要作用,亦可用于緩解急性疾病臨床癥狀[3]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,中醫(yī)藥事業(yè)逐步吸收了多種現(xiàn)代化生產(chǎn)技術(shù),出現(xiàn)了更多的新工藝、新輔料和新劑型,而信息技術(shù)、基因技術(shù)、細(xì)胞工程等高科技技術(shù)也被不斷引入中醫(yī)藥領(lǐng)域當(dāng)中。在中藥制劑現(xiàn)代化發(fā)展過程中,提高制劑的質(zhì)量是首要指標(biāo)。藥劑質(zhì)量的優(yōu)劣需建立在嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上,但目前我國中藥制劑的質(zhì)控體系尚未完善,對(duì)其應(yīng)用范圍造成了不良影響,如何提高中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化水平,成為目前中醫(yī)藥領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)問題。疏風(fēng)清熱合劑中黃芩屬于主藥,其含有黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、寒黃芩苷等多種黃酮類化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[4],黃芩抗病毒、抗菌作用明顯,對(duì)乙肝病毒、流感病毒、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均有強(qiáng)效抑制作用。黃芩苷(Baicalin,分子式C21H18O11,分子量446.37)單品為淡黃色結(jié)晶粉末,溶解性低,能溶于甲醇但幾乎不溶于水,黃芩苷能抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗乙酰膽堿、抗組胺,并對(duì)抗原抗體反應(yīng)過程中化學(xué)遞質(zhì)的釋放量具有減少的作用。探討測(cè)定疏風(fēng)清熱合劑中黃芩苷含量的有效方法,對(duì)提高藥品質(zhì)量控制水平有重要意義。

現(xiàn)有藥典中關(guān)于中藥制劑指標(biāo)成分測(cè)定多以定性檢測(cè)為主,甚至僅使用顯微鏡檢定,缺乏定量檢測(cè)。此外,受不同批次、不同生產(chǎn)商、不同地區(qū)的影響,即使是同一制劑也會(huì)存在有效含量差異,對(duì)制劑療效造成嚴(yán)重影響[5]。以往測(cè)定中藥制劑中某一藥物含量時(shí)多采取薄層色譜法,但其準(zhǔn)確性、精密度、敏感性、重復(fù)性較差,難以滿足質(zhì)控需求。隨著檢測(cè)方法的發(fā)展,目前用于分離、分析中藥制劑的方法不斷涌現(xiàn),包括質(zhì)譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳、液相色譜——質(zhì)譜、氣相色譜——質(zhì)譜、高效液相色譜法等,為中藥制劑的有效含量測(cè)定和質(zhì)量控制研究提供了新的方法。高效液相色譜法屬于是色譜法的分支,其流動(dòng)相為液體,以高壓輸液系統(tǒng)將極性不同的單一溶液或比例不同的緩沖液、混合液泵入存在固定相的色譜柱,溶液各成分在色譜柱內(nèi)分離后進(jìn)入紫外線檢測(cè)器檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)試樣分析和定量測(cè)定。有研究認(rèn)為[6],80%的有機(jī)化合物均可使用HPLC進(jìn)行分析檢測(cè),其具備高壓、高效、高速、高準(zhǔn)確性、適用范圍廣的特征,目前多用于對(duì)重要制劑中的主要成分含量進(jìn)行分析。

檢測(cè)黃芩苷含量時(shí)通常以C8柱或ODS柱為固定相,以甲醇——水——磷酸為流動(dòng)性,通過波長276～280nm的紫外線檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。李會(huì)婷[7]等人通過HPLC法同時(shí)測(cè)定藍(lán)芩口服液中梔子苷、綠原酸和黃芩苷含量,以O(shè)DS色譜柱為固定相,以甲醇——磷酸溶液(45∶55)為流動(dòng)性,在1.0mL/min和280nm波長的條件下結(jié)果顯示黃芩苷線性范圍為0.25～1.16g,r=0.999,平均回收率99.90%,標(biāo)準(zhǔn)差0.73%;郝乘儀[8]等人則以C18柱為固定相,以含0.5%磷酸的甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行檢查,在278～324nm波長條件下測(cè)定,結(jié)果顯示黃芩苷保留時(shí)間為4.8min,與相鄰峰分離度>1.5,回收率97.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.55%,以上研究結(jié)果均提示HPLC能同時(shí)測(cè)定試劑中的多種有效成分含量。本研究中,紫外線檢測(cè)器以200～400nm波長范圍進(jìn)行掃描,在280nm波長處吸收最大,且樣品溶液的其他成分未對(duì)黃芩苷色譜峰造成影響,因此以280nm作為黃芩苷含量測(cè)定的最佳檢測(cè)波長;但考慮到黃芩苷存在較強(qiáng)的極性,因此采取反向HPLC進(jìn)行測(cè)定;在流動(dòng)相選擇方面,配比為47∶53∶0.2的甲醇——水——磷酸出峰時(shí)間最合適且峰型滿意。在以上色譜條件下保留時(shí)間4.1min時(shí)對(duì)照品和樣品溶液有色譜峰出現(xiàn),陰性對(duì)照液無此色譜峰,提示HPLC測(cè)定黃芩苷可避免其他雜質(zhì)峰干擾。

綜上所述,高效液相色譜法測(cè)定疏風(fēng)清熱合劑黃芩苷含量簡單快速,且測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,可用于制劑的質(zhì)量控制。