干血點一種新型反興奮劑檢測技術

甄世樂

（西北師范大學 甘肅 蘭州 730000）

體育運動中興奮劑只是一種統稱，泛指世界反興奮劑機構（WADA）明令運動員或其教練員在運動訓練中禁止使用的物質和方法，由每年發布的《禁用清單》劃定其違禁范圍。而這清單中的一些新型興奮劑以非常小的劑量使用，稱為微劑量，以逃避檢測或其中一些物質結構與身體自身合成代謝的物質又極其相似無法準確判斷出是否使用了違禁物質，興奮劑檢測難度越來越大。隨著新型興奮劑的不斷使用，新型檢測興奮劑的技術也隨之迅速發展。液相色譜和質譜連用的檢測技術通過與干血點（dried blood spot，DBS）技術的結合能夠對大部分禁用清單中的物質進行檢測，現已成為興奮劑檢測中配合尿液檢測的重要輔助檢測方式。

相較于傳統的靜脈血采集取樣干血點（DBS）采樣技術只需從足跟，耳朵或手指點刺收集通常為20μl的毛細血管血液體積是微創性的。同時與傳統的樣品基質均為液體（尿液，血漿，血清）相比干血點（DBS）只需將樣品保存在濾紙上具有穩定性和易保存性。這極大地簡化了儲存和運輸條件。因此該技術在興奮劑檢測中受到了越來越多的關注。干血斑（DBS）是一種在濾紙上干燥的全血標本的采樣技術，已有接近60年的歷史。1963年，Robert Guthrie首次報道了這種使用足跟刺血的微量采樣方法的應用，該測定方法引入了一種用于新生兒苯丙酮尿癥診斷研究的測定方法。隨后的應用中特別是在新生兒代謝紊亂篩查中被廣泛應用。在過去的幾十年中，通過液相色譜法與質譜相結合的DBS分析已經牢固確立，并且檢測物質數量大大增加。廣泛用于疾病監測（例如癌癥，糖尿病），臨床前藥物開發，毒理學和藥代動力學研究，治療藥物監測（TDM）和代謝組學分析。

這種檢測技術應用于興奮劑檢測是極有潛力的，在興奮劑檢測領域受到了很高的重視，各國專家學者也進行了廣泛的研究。隨著2022年北京冬奧會的圓滿舉辦新型興奮劑檢查檢測手段“干血點”也成功完成在奧運會的正式亮相。這是首次將干血點檢查檢測作為興奮劑常規檢測手段。去年東京奧運會上，干血點技術進行試驗性應用，而在北京冬奧會上，干血點檢測正式被使用，這項反興奮劑技術我國也全程參與了研發。本文便從DBS采樣技術的優勢以及對興奮劑禁用清單中的物質檢測范圍方面的研究現狀進行分析討論，為進一步使DBS采樣技術應用于我國運動員訓練過程中興奮劑的監測提供依據。

1、干血點（DBS）采樣的優勢

干血點（DBS）采樣是一種新型樣本采樣技術和樣本形態，稱為干血點，也被稱為干血斑或干血片。它是通過刺穿受試者皮膚毛細血管來收集一小滴指尖或足跟全血于樣本采集卡上經室溫干燥后形成血斑。再經過溶劑萃取后，通過串聯質譜等后端檢測設備可對干血斑中待檢測物質進行檢測分析。因此該技術在運動員興奮劑采樣檢測中具備以下優勢。

1.1、樣本采集對運動員損傷小、便于采集

興奮劑檢測中靜脈采血根據世界反興奮劑組織機構（WADA）的要求，需要對運動員進行靜脈采血。靜脈采血需要對運動員的皮膚進行穿刺以獲取大量的靜脈血液來得到進行興奮劑檢測所需要的足量血漿。而干血點（DBS）采樣技術只需要從運動員指尖或者上臂利用專業設備來進行微小的穿刺采樣，相比于靜脈采血其對運動員身體的侵入性較小只是微創對運動員造成的損傷也更小。由于采血量很少大約只有100μL可以直接將指尖或者上臂血液滴到采樣卡上來制備運動員的干血點樣本。樣本采集簡單且采血量小所用時間與靜脈采血相比也更少，便于運動員興奮劑檢測時的采樣工作。同時對采集環境與人員要求相較于靜脈采血也比較低，可以在同一時間、地點對運動員進行大量的采樣非常的便捷。在世界上眾多的宗教信仰與各地的法律法規中存在一些不能進行靜脈采血的禁忌情況，而干血點（DBS）采樣技術則能夠很好地在遵守當地法律法規的同時完成對運動員的血液興奮劑檢測。

1.2、樣本的運輸與儲存方便、經濟

在目前興奮劑檢測程序中，對運動員所采集的樣本均以液體的形式來進行運輸與儲存，采集到的全血樣本被要求在低溫環境下進行儲存與運輸。而干血點（DBS）則便于保存與運輸，樣品保存到帶干燥劑的密封袋中，可在室溫下儲存數周至數年，與全血液體保存的方式相比不需要放入冷藏柜中儲存時所占用的空間也更小，相同空間中所能儲存的樣本量更多更方便。根據興奮劑檢測程序規定所采集的樣本需要被送到國際奧委會醫學委員會授予的具有國際檢測資格的興奮劑檢測實驗室中進行檢測分析，在這運輸過程中傳統液體樣品需要長期的保存在低溫環境中。因此，要耗費巨大的資金資源來進行運輸與儲存。但是DBS樣本則在常溫環境中就能夠輕易地儲存與運輸并不需要在運輸過程中進行制冷處理，這極大地減少了資金的支出相比于傳統的樣品運輸與儲存成本更低、更經濟。并且能夠很好地在偏遠地區進行樣品的采集工作，與傳統的樣品收集相比具有很大的優勢。

1.3、采集樣本中的物質具有更高的穩定性

傳統樣本基質均是以液體的形式（尿液、血漿、血清）來保存，這些液體樣本中的物質只有在低溫環境中才能防止產生緩慢的變化，一些物質甚至在低溫環境中也能夠逐漸分解使其濃度降低，（例如，類固醇脂）這便會影響檢測結果的準確性。而且液體樣本很容易因為暴露于外界環境之中而產生樣本污染的問題。干血點（DBS）樣本的基質在室溫環境中也能夠長時間保存，對于某些禁止物質及其亞類可能會在其他類型的基質中更快的分解為其他物質。如果樣品中存在不穩定化合物，則應根據實際情況儲存在（2-8℃或－60℃）環境中也能夠長期穩定的保存。DBS的基質性質以及分析物的吸附作用使得 DBS中的分析物有較低的反應性。DBS樣本穩定性的提高可能是由于酶促降解過程失活而優于血漿，樣品中存留的水分是化合物發生酶解或水解的關鍵因素。因此，DBS樣本相較于傳統樣本中保存的分析物質更具有穩定性。

2、干血點（DBS）采樣技術對興奮劑禁用清單中物質的檢測

世界反興奮劑機構（WADA）每年都會發布禁用物質與禁用方法的《禁用清單》，其中明確規定了在體育運動中禁止使用的物質種類與方法。根據物質在人體中的不同作用機制，可以分為10類禁用物質、3種禁用方法和1類特殊項目禁用物質。在這些禁用物質當中有很多必須通過不同的代謝物、降解產物或生物標記物等進行監測以判斷是否使用了這些違禁藥物。這些清單中物質的分解代謝大多是隨尿液的排出而被釋放出體外，但是也有一些物質不能通過尿液檢測出來比如血液類的興奮劑，這些物質只有通過對運動員進行血檢才能被發現。因此干血點（DBS）采樣技術既彌補了靜脈血檢對運動員產生的損傷于復雜的采集程序又可以很好地作為尿檢的一種補充。干血點（DBS）采樣技術在對禁用清單中的物質檢測方面已進行了許多的研究，并且在這方面我國也全程參與了研發，在2022年北京冬奧會上也首次使用DBS采樣技術對運動員進行了興奮劑檢測。本文從2022年我國最新發布的《興奮劑目錄》中種類最多的蛋白同化制劑、肽類激素、刺激劑這幾個方面對干血點（DBS）采樣技術在禁用清單中物質的檢測進行闡述。

2.1、蛋白同化制劑的檢測

蛋白同化制劑又稱同化激素是合成代謝類藥物也就是我們俗稱的合成類固醇，具有促進蛋白質的合成與分解的特征，能夠促進肌肉生長，提高身體力量增強男性特征。根據世界反興奮劑機構公布的數據顯示，在運動員被檢測出興奮劑的使用中合成類固醇使用的比例最高，這也導致了合成類固醇的準確檢測成為了興奮劑研究人員一直以來關注的重點。合成代謝類固醇睪酮自1976年以來被國際奧林匹克委員會（IOC）禁止，但仍然是最常檢測到的興奮劑之一。睪酮是一種類固醇激素，在人體由膽固醇合成，它能夠調節許多生理過程，包括肌肉蛋白質代謝，紅細胞生成和改變血漿脂質水平等。運動員攝入后能誘導瘦體重和肌肉力量的增加，以及疲勞恢復時間的縮短。由于睪酮人體自身也能夠產生，普通尿液檢測無法確定其是否為運動員自身的內源性睪酮還是違規攝入的外源性睪酮。Forsdahl Guro等人通過使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對6名受試者進行了睪酮脂的臨床研究，研究結果表明在給藥后的血液樣品中，所有被調查的睪酮酯都能被檢測到。LauraTretzel等人通過使用高效液相色譜（HPLC）耦合高分辨率串聯質譜（HR-MS/MS）對DBS樣本中的8種合成代謝類固醇酯（苯丙酸諾龍，庚酸曲恩龍，醋酸睪酮，環己酸睪酮，異己酸睪酮，苯基丙酸睪酮，癸酸睪酮和十一酸睪酮）和諾德龍進行了檢測。結果表明，通過液相色譜高分辨率/高精度質譜法能夠精確的這些物質并能夠明確的證明外源性睪酮及其衍生物的結合物的施用。Jing Jing等人基于確定運動員濫用合成類固醇脂的目的，開發驗證了一種全自動的在線DBS制備與檢測方法，用于通過DBSA-TLX-HRMS系統對13種合成代謝類固醇酯進行篩選和定量分析。結果發現該系統能夠對合成類固醇脂進行符合WADA標準的有效檢測，證明了自動化DBS分析在摻雜控制中檢測合成代謝類固醇酯的適用性。干血點（DBS）技術與液相質譜檢測技術結合在運動員是否使用了蛋白同化制劑類的興奮劑監測中具有很大的發揮潛力。楊聲等人建立了液相色譜-高分辨離子軌道阱質譜法從干血點中提取并檢測睪酮酯類興奮劑的新方法，解決了辨別外源性睪酮的難題，已通過ISO-17025質量體系認證，作為一種睪酮類興奮劑藥物的有效檢測手段，在北京2022年冬奧會、冬殘奧會的反興奮劑檢測中進行了應用。

2.2、肽類激素的檢測

從1989年國際奧委會將肽類激素定為新一類興奮劑以來 ,對這類物質的檢測研究便一直是反興奮劑研究中重點關注的熱點藥物。這類物質具有外源性藥物（肽類興奮劑）與內源性激素（人體自然產生）區別小，在人體內藥物代謝時間短的特點，曾長期無法被準確可靠的檢測而被運動員廣泛濫用。Tobias Lange等人通過近紅外光譜從干血斑（DBS）中進行機器人輔助非破壞性血細胞比容測量，然后通過LC-HRMS檢測全自動樣品制備，包括強陽離子交換固相萃取和蒸發，從而能夠檢測出46種低分子質量（＜2 kDa）肽、非肽藥物和候選藥物。Gemma Reverter-Branchat等人開發了一種分析程序，用于從DBS中提取GHRP-2及其主要代謝物（AA-3），并通過液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測它們。該方法經過他們的驗證，可用于檢測GHRP-2。特異性和識別能力的評估也符合WADA規定的興奮劑指南中的要求。并且檢測GHRP-2的限值確定到了50pg/ml，證實了長期穩定性能夠達到兩年以上。他們的研究提供了具體證據，支持DBS在檢測GHRP-2以及潛在的其他GHRP家族成員進行興奮劑檢測方面的有效性。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是生長激素作用的主要介質，并被用作檢測rhGH濫用的生物標志物。干血斑（DBS）中GH生物標志物的測量將大大簡化樣品收集和運輸方法。基于以上原因Holly D.Cox等人開發并驗證了一種通過液相色譜串聯質譜法定量測量DBS中完整IGF-1蛋白的方法。該方法被證明具有良好的特異性，精度和準確性可以應用于反興奮劑領域和rhGH濫用檢測。

2.3、刺激劑的檢測

這是一類最早被運動員使用，也是最早被禁止的一類興奮劑，也是最原始意義上的興奮劑，作用效果速度快，能夠對神經肌肉起到直接的興奮刺激作用。Asami Kojima等人研究描述了液相色譜串聯質譜法運用干血點檢測與定量實驗的尿液進行比較來檢測黃麻堿和甲基黃麻堿。結果表明，麻黃堿和甲基麻黃堿的尿液排泄會受到尿液pH值或尿量的強烈影響。這表明，尿液濃度不能反映運動員循環系統中麻黃堿的精神活性水平。因此，干血分析能適用于在競爭測試期間充分檢測興奮劑。Fathiah A Zubaidi等人使用了一種基于MRM-EPI-MRM多周期-多實驗的液相色譜串聯質譜技術對干血點（DBS）中苯丙胺類興奮劑相關的藥物進行了檢測。研究中分析的ATS相關藥物包括麻黃堿，偽麻黃堿，安非他明，甲基苯丙胺，MDMA（3，4- 亞甲二氧基甲基苯丙胺），MDA（3，4- 亞甲二氧基苯丙胺），MDEA（3，4-亞甲二氧基-N-乙基苯丙胺）和芬特明。結果表明，該方法能夠快速而簡單的確認苯丙胺類興奮劑的使用，且具有更高水平的可信度。

3、DBS對我國運動員在訓練中進行興奮劑監測的應用前景

干血點（DBS）技術在2022年北京冬奧會上被首次作為一種興奮劑的檢測方式應用于對參賽運動員使用違禁物品的檢測，這項技術我國全程進行了參與和相關設備的研發,2019年開始與國際奧委會、世界反興奮劑機構、國際檢查機構、美國反興奮劑中心等共同進行研發等工作。2021年5月，中國反興奮劑中心（北京實驗室）順利通過干血點擴項檢測認可。我國成為世界上率先開展干血點檢查的國家之一。根據世界反興奮劑機構規定的《監察調查國際標準》中的規定，干血點樣本采集器材需要獨立的制造商且還需滿足ISO/IEC 17025認可的實驗室檢測，中國反興奮劑中心便和浙江大學、國藥集團與浙江奧泰等單位合作研制了干血點樣本采集器材，并在北京冬奧會和冬殘奧會上運用干血點采樣技術對運動員全面實施常規檢查。我國已經為使用干血點(DBS)技術在運動員興奮劑檢查領域的推廣應用做好了準備。

干血點（DBS）技術具有采樣量少、微創和運輸及儲存成本低的特點，不受樣本采集、檢測的時間和地點所限制。這便為運動員興奮劑的檢測提供了一種便捷且容易監測的方法。在訓練過程中可以經常、不定期的對運動員進行采血為運動員個人提供更多的檢測數據，對運動員進行一個時時監測。隨著干血點（DBS）在2022年北京冬奧會上的成功應用，通過該技術對我國運動員在訓練、備戰過程中提供了有力支持，能夠避免違規使用興奮劑的現象，保障了訓練、比賽、日常生活和傷病治療中誤服誤用興奮劑事件的發生從而造成的興奮劑檢測陽性的結果。

4、結束語

干血點雖然在2022年北京冬奧會中進行了首次亮相但其在興奮劑檢測中的應用以初具鋒芒，憑借著其與傳統血液基質相比微量、微創、易保存的特點，可以成為尿檢的很好補充。隨著實驗室對樣本的自動化檢測程度的不斷提高，DBS采樣技術可以提高檢測的效率和有效性，推動興奮劑的檢測向自動化發展。雖然通過DBS采樣技術與液相色譜串聯質譜技術現已能夠檢測出許多違禁物質但還需要開發更加靈敏的檢測技術進一步提高對違禁物質檢測的靈敏性和擴大檢測范圍，對未來建立運動員興奮劑生物護照奠定基礎。為反興奮劑技術的發展，提升捍衛純潔體育的能力做出重大貢獻。隨著DBS技術的成熟，對于我國運動員在訓練過程中的興奮劑監測工作也做好了充分的準備，希望這種新型采樣技術能夠在我國反興奮劑領域得到更加廣泛的應用，從我國自身做起維護體育運動的公平與公正。