基于生物信息與網絡藥理學探討人參治療冠心病的分子機制*

葛亞如，王承龍

中國中醫科學院西苑醫院/國家中醫心血管病臨床醫學研究中心，北京 100091

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)又稱缺血性心臟病，是指冠狀動脈粥樣硬化形成粥樣斑塊，導致血管管腔狹窄甚至阻塞，引起心肌缺血缺氧或壞死而形成的心臟病，是臨床常見的慢性心血管疾病。其發病因素與高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖及遺傳因素等有關，常用的治療手段包括血運重建、二級預防藥物治療[1]。人參為五加科植物人參的干燥根，《神農本草經》載“人參，味甘，微寒。主補五臟，安精神，定驚悸……[2]”張錫純謂其：“人參補氣之力，實倍于補血……[3]”故將人參的功效總結為補益氣血。現代藥理研究發現，人參的活性成分主要有皂苷類、多糖類、有機酸和蛋白質等[4-5]。研究發現，人參皂苷Rb3能明顯降低大鼠心肌梗死不同階段血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β及轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1的水平，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[6]。人參皂苷Rb1可激活人體主動脈內皮細胞中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase-alkaline protein kinases，PI3K-Akt)、絲裂原活化蛋白質激酶的激酶/細胞外信號調節激酶(mitogen-activated protein kinase kinase /extracellular signal-regulated protein kinase，MEK/ERK)信號通路，引起內皮型一氧化氮合酶(endothelial-type nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化，增加一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)釋放[7]。人參多糖能顯著降低冠心病大鼠的死亡因子(factor associated suicide，Fas)、B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)及Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)表達水平，具有抗氧化、保護心肌線粒體的作用[8]。但上述研究都是通過基礎研究或查閱文獻發現可能的靶點和通路，難以體現中藥治療疾病多靶點、多通路的特點，故需要通過大數據挖掘人參與冠心病之間的靶點通路。

本文通過生物信息學與網絡藥理學技術方法，篩選人參治療冠心病潛在的靶點和通路，為后續中藥的研發和臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 資料庫及研究流程正文所涉及的資料庫見表1，研究流程見圖1。

表1 人參治療冠心病作用靶點篩選所用數據庫基本信息

圖1 人參治療冠心病的分子機制研究流程圖

1.2 人參化學成分及靶點篩選使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]搜索人參的主要化學成分，建立人參化合物數據庫。根據TCMSP 數據庫中藥物動力學(absorption and distribution and metabolismand excretion，ADME) 參數，構建包括口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、藥物類藥性(drug-likeness，DL)在內的綜合模型以此來篩選潛在活性化合物，以OB≥30%和DL≥0.18作為閾值篩選化合物。

然后將在TCMSP數據庫中獲取的化合物的潛在靶點上傳至UniProt數據庫進行靶點注釋[10]，限定物種為人，獲得蛋白靶點對應的基因信息并導入Cytoscape 3.8.2構建“中藥-化合物-靶點”網絡圖。

1.3 冠心病疾病靶點篩選以“coronary heart disease” 為關鍵詞，通過篩選OMIM、Drugbank、GeneCards、TTD、DisGeNET疾病數據庫[11-14]，合并去重后獲得冠心病相關靶點，并利用Uniprot 數據庫獲得冠心病靶點的Uniprot ID，以備后續統計分析。

1.4 人參-冠心病共同靶點獲取將化合物靶點與疾病靶點取交集，利用R程序繪制韋恩圖，獲取人參治療冠心病的共同靶點，并導入Cytoscape 3.8.2構建“人參-共同靶點-冠心病”網絡以備后續分析。

1.5 關鍵共同靶點篩選及分析將藥物-疾病共同靶點輸入STRING數據庫[15]，選取minimumrequired interaction score>0.9，構建蛋白質相互作用(proteinproteininteraction，PPI)網絡圖，將結果保存成tsv文件，使用Cytoscape軟件構建PPI網絡，借助Cytoscape的工具分析包計算網絡中節點的拓撲學屬性，根據度值(Degree)、間距中心度(betweeness centrality，BC)及緊密中心度(closeness centrality，CC)等參數篩選出關鍵共有靶點網絡及核心靶點，其中設置Degree值大于2倍中位數的為關鍵靶點，構建PPI網絡。

1.6 富集分析基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，將藥物與疾病的關鍵共同靶點上傳至DAVID平臺，參數設置為Hspecies，即可獲取GO功能富集分析中的分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和KEGG信號通路富集分析結果，以P<0.05為富集分析結果有統計學意義，利用R軟件將結果以氣泡圖形式輸出。

1.7 構建人參-共同靶點-通路網絡圖對1.5中獲得的藥物-疾病共同靶點以及1.6中獲得的通路名稱，制作network.xlsx和type.xlsx文件，導入Cytoscape軟件，利用Network Analyzer工具包計算網絡中節點的拓撲屬性，然后根據Degree值設置藥物、靶點以及通路大小，菱形表示人參，橢圓形表示靶點，矩形表示通路，構建人參-共同靶點-通路網絡圖。

1.8 關鍵化合物與核心靶點的分子對接為觀察人參進入機體后，能否和機體的靶蛋白結合從而發揮藥效，將人參的關鍵化合物與篩選出的7個關鍵核心靶點進行分子對接。首先從PubChem數據庫[16]下載人參化合物的2D結構，保存成SDF格式，然后利用軟件ChemBio3D對化合物結構進行優化，保存成Mol2格式。在PDB數據庫檢索靶基因蛋白構象[17]，并根據以下條件進行篩選：①通過X晶體衍射法獲取的蛋白結構；②蛋白的晶體解析度<2.5 A；③分型明確的蛋白。利用IGEMDOCK軟件進行關鍵化合物與核心靶點的分子對接，得到分子對接數據[18]。使用PyMOL軟件對化合物與蛋白的相互作用進行繪制[19]。

1.9 觀察指標主要包括篩選的基因靶點及相關通路。

2 結果

2.1 人參化學成分篩選及靶點獲取根據設置的篩選條件，以“Homosapiens”為檢索物種，共檢索到17種中藥有效成分(見表2)，去除重復靶點并通過Uniprot數據庫中已經篩選出的靶蛋白進行標準化注釋，最終獲得111個藥物作用靶點。通過TCMSP篩選中藥化學成分并獲取靶點后，導入Cytoscape 3.8.2 軟件構建人參成分-靶點相互作用網絡圖(見圖2)，其中綠色圓形節點代表人參活性化合物(RSn)，藍色菱形節點代表人參作用靶點，連線代表化合物與靶點的相互作用關系。

注：綠色節點代表人參活性化合物；藍色節點代表預測靶點圖2 人參成分-靶點相互作用網絡圖

表2 人參化合物信息

2.2 人參-冠心病靶點韋恩圖分析將獲取的中藥靶點與目標疾病相關聯的靶點進行韋恩圖疊加分析，可以快速得到藥物與疾病相互作用的目標靶點。通過篩選上述疾病數據庫合并去重后共獲得冠心病相關靶點1 886個，人參預測獲得的靶點111個，利用R程序包繪制人參預測靶點與冠心病靶點韋恩圖，得到58個共同靶點，見圖3。

注：Disease表示冠心病，Drug表示人參，兩圓重合部分表示58個共同靶點圖3 藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.3 關鍵共同靶點篩選通過Cytoscape中BisoGenet軟件繪制共同靶點間的相互作用網絡并進行拓撲分析，選取Degree≥二倍中位數，BC及CC大于中位數逐次篩選出關鍵共同核心靶點，共涉及175個節點(node)和3 406條邊(edge)，見圖4。

圖4 人參-冠心病關鍵靶點網絡圖

2.4 人參治療冠心病共同靶點的PPI網絡分析構建藥物治療目標疾病的潛在靶點PPI網絡有助于更系統地研究疾病分子機制，更直觀地了解藥物與疾病之間潛在靶點的關聯。將上述獲得的58個藥物-疾病共同靶點輸入STRING數據庫，構建人參治療冠心病共同靶點的PPI網絡(圖5)。網絡中共有58個節點和425條邊。通過Network Analyzer工具包分析，選取Degree≥二倍中位數，得到7個關鍵共有靶點和21條邊。關鍵靶點間的詳細信息見表3。

注：菱形紅色節點表示Degree≥28的靶點，其他圓形藍色節點表示Degree<28的靶點，節點越大代表該節點在網絡中越重要。AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，TNF為腫瘤壞死因子，PTGS2為前列腺素內過氧化物合酶2，IL-1β為白細胞介素1b，CASP3為半胱天冬酶，JUN為JUN原癌基因，NOS3為一氧化氮合酶3圖5 人參治療冠心病的PPI網絡圖

表3 人參治療冠心病的關鍵靶點信息

2.5 GO功能、KEGG信號通路富集分析將58個共同靶點導入DAVID平臺進行GO功能、KEGG功能富集分析，分別得到416個GO功能、富集分析條目及97個KEGG信號通路富集分析條目。MF富集結果共包含61個條目，主要涉及蛋白質結合、酶結合、受體結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、血紅素結合等方面。BP富集結果共有299個條目，主要涉及調控轉錄、凋亡過程、信號轉導、細胞增殖、炎癥反應、氧化還原、血管生成等方面。CC富集結果共有35個條目，主要涉及內質網、質膜、細胞溶質、細胞質等方面。根據P值大小(P<0.01)，用條形圖分別列舉了各類前10位的條目(圖6)。

圖6 GO功能富集分析

對KEGG信號通路富集分析結果中前20條通路進行可視化處理，見圖7。圖中氣泡的大小表示該條目下基因的個數，氣泡越大則基因數越多；顏色表示調整后的P值，顏色越紅表示P值越小，富集結果越明顯。根據Count值排序，大于中位數(6)的通路主要有TNF(12)、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)(10)、PI3K-Akt(9)、MAPK(8)、Toll樣受體(8)及核蛋白因子-κB(Nucleoprotein factor-κB，NF-κB)(8)信號通路，其中TNF及cAMP信號通路更為重要，選擇這些條路進行繪制，見圖8、圖9。

圖7 KEGG信號通路富集分析

注：圖中矩形框代表基因(蛋白質)，白色節點代表通路蛋白，紅色代表人參的關鍵作用靶點，實線箭頭代表激活，虛線箭頭代表間接關系，兩個箭頭中間帶圈的表示表達圖8 KEGG-TNF信號通路

注：圖中矩形框代表基因(蛋白質)，白色節點代表通路蛋白，紅色代表人參的關鍵作用靶點，實線箭頭代表激活，虛線箭頭代表間接關系，兩個箭頭中間帶圈的表示表達圖9 KEGG-cAMP信號通路

2.6 構建人參-共同靶點-通路網絡圖篩選KEGG信號通路條目中Count值>中位數(6)的條目共37條，然后構建人參-共同靶點-通路網絡圖，見圖10。網絡中節點越大表明該節點越重要，該網絡中共包含41個藥物-疾病共同靶點、37條KEGG信號通路、79個節點和368條邊。共同靶點根據Degree值進行排序，前10位的靶點分別是AKT1、TNF、PI3KCG、NF-κBIα、JUN、IL-1β、CASP3、TGF-β1、BCL2、CASP8。

注：黃色菱形表示人參，綠色橢圓形表示共同靶點，紅色矩形表示通路。RS表示人參；AKT1為絲氨酸/蘇氨酸激酶1；TNF為腫瘤壞死因子；PI3KCG為磷脂酰肌醇3-激酶；NF-κBIα為NF-κB 抑制劑α；JUN為JUN原癌基因；IL-1β為白細胞介素1β；CASP3半胱天冬酶3；TGF-β1為轉化生長因子β1；BCL2為B細胞淋巴瘤2，是一種細胞凋亡調節因子；CASP8為半胱天冬酶8圖10 人參-共同靶點-通路網絡圖

2.7 關鍵化合物與核心靶點的分子對接選取Degree值>中位數(10)的化合物共9個，與7個核心靶點進行分子對接。IGEMDOCK軟件分子對接結果以能量高低來判斷化合物與靶點的結合程度，能量值越低代表親和力越大，具體對接結果信息見表4。ginsenoside rh2與PTGS2結合親和力最強，對其進行可視化分析，見圖11。

表4 關鍵化合物與核心靶點的分子對接 (kcl·mol-1)

圖11 PTGS2與ginsenoside rh2的分子對接模式圖

3 討論

《中國心血管健康與疾病報告2020概要》指出，中國心血管患病率處于持續上升階段，冠心病現患人數為1 139萬，并且其發病趨勢呈年輕化，給家庭及社會造成巨大的負擔[1]。目前，冠心病的治療藥物主要以二級預防藥物為主，如抗血小板藥物、β受體阻滯劑、降血脂血壓藥物等。冠心病屬中醫“胸痹心痛”范疇。人參大補元氣，主治氣虛證、氣虛血瘀證，已經被證實治療冠心病有效，但有關人參治療冠心病靶點和通路的研究有限，大部分通過前期試驗或文獻查閱所得，所以本文旨在通過網絡藥理學的方法探討人參治療冠心病的分子作用機制。

文章按照設置的篩選條件，共篩選出17個人參的有效成分，58個人參-疾病共同靶點，按Degree值篩選出7個關鍵共同靶點，主要與炎癥、免疫及細胞增殖凋亡等相關，包括AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN、NOS3。

AKT1是3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2、AKT3)之一[20]，參與調節包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等多種過程，是PI3K-Akt信號轉導途徑的重要中間分子，與動脈粥樣硬化斑塊形成有關，是心血管疾病的關鍵參與者[21-22]。TNF作為NF-κB通路的上游信號分子，可促進其他細胞因子和趨化因子的產生，加劇冠心病的慢性炎癥反應，對于啟動炎癥-免疫應答、動員級聯反應具有重要作用[23]。PTGS2亦稱環加氧酶，負責參與炎癥和有絲分裂的前列腺素的生物合成，其作用途徑與催產素信號轉導和免疫反應有關途徑相關，參與調節細胞增殖和抑制細胞凋亡過程[24]。IL-1β是一種強效的促炎細胞因子，通過與TNF和IL-6協同誘導血管內皮生長因子產生，在血管生成中發揮作用。CASP3參與細胞凋亡、壞死和炎癥的信號通路。NOS3是產生NO的一種合酶，PI3K-Akt-NOS通路的抑制會影響NO的釋放，加劇血管收縮，加重冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成、缺血。冠心病患者的血管長期處于炎癥狀態，TNF、IL-1β等促炎因子升高，而促炎因子的過度釋放會導致細胞毒性，損傷心血管內皮細胞結構和功能[25-26]。冠心病患者心肌細胞可能會出現壞死、凋亡等過程，導致功能性心肌細胞含量減少。文章中PPI網絡發現，人參通過作用于CAPS3、BCL2等凋亡基因，抑制Caspase3表達及Bcl2/Bax比例從而減少心肌細胞凋亡，維持冠心病患者心肌細胞正常形態和功能。研究表明，在人體主動脈內皮細胞中，人參可激活PI3K-Akt信號通路，引起eNOS磷酸化，增加NO釋放，并能減輕細胞脂質過氧化損傷；在人臍靜脈內皮細胞中，人參可通過下調microRNA的表達，增加eNOS合成，促進細胞遷移及血管生成[27-28]。

GO功能富集分析結果顯示，人參治療冠心病的生物學進程主要集中在炎癥反應、細胞增殖與凋亡。KEGG信號通路富集分析結果表明，疾病-藥物共同靶點主要富集在TNF、cAMP、PI3K-Akt及MAPK信號通路。根據人參-共同靶點-通路網絡圖，在Cytoscape數據庫中，利用“Ctrl+6”“Ctrl+N”快捷鍵，可以看出有12個靶點參與了TNF信號通路，其中有關鍵靶點AKT1、TNF；有10個靶點參與了cAMP信號通路，其中有關鍵靶點AKT1、JUN；有9個靶點參與了PI3K-Akt信號通路，其中關鍵靶點AKT1、NOS3參與了該過程；各有8個靶點參與了MAPK和Toll樣受體信號通路，其中有靶點AKT1、TNF。從而可知，人參的重要靶點AKT1主要通過TNF、cAMP、MAPK、PI3K-Akt及Toll樣受體信號通路發揮抗炎與抑制心肌細胞凋亡的作用。另外，TNF靶點有21條通路，在關鍵通路中與TNF、MAPK、Toll樣受體和NF-κB信號通路有關；PIK3CG靶點有21條通路，在關鍵通路中與TNF、PI3K-Akt、cAMP、Toll樣受體信號通路有關；NFKBIA靶點有18條通路，在關鍵通路中與TNF、NF-κB、cAMP和Toll樣受體信號通路有關。

采用分子對接技術，將人參中的主要成分山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、富馬酸(fumarine)、豆甾醇(stigmasterol)、山槐素(inermin)、吉九里香堿(girinimbin)、4-羥基苯甲酸(dianthramine)、花生苷酸(arachidonate)和人參皂苷Rh2(ginsenoside rh2)，與核心靶點AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN和NOS3進行結合能力測試，結果發現人參皂苷rh2與PTGS2結合能力最強。

綜上所述，人參通過AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN、NOS3等關鍵靶點與TNF、cAMP、MAPK、PI3K-Akt、Toll樣受體及NF-κB等多條主要信號通路發揮抗炎、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的方式治療冠心病。網絡藥理學的應用為中藥治療疾病的研究提供了新的方法和技術，有助于更高效地預測相關靶點和通路，但是后續仍需體內或體外實驗加以驗證。