基于Nrf2/Keap1信號通路研究黃芩甲苷對糖尿病腎病模型小鼠腎損傷的作用*

彭福梅，尹青橋，李相友

武漢市第三醫院，湖北 武漢 430060

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)屬于糖尿病常見并發癥，隨疾病發展極易導致慢性腎衰竭，威脅患者生命安全[1]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ech-associated protein 1，Keap1)可在生理狀態下與核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)發生耦聯，當機體發生病理性改變時，Keap1水平也會發生相應變化[2]。Nrf2參與細胞氧化還原平衡調節，已有報道指出，激活Nrf2可有效治療DN導致的腎損傷[3]。研究指出，Keap1可被Nrf2激活，進而影響miR-142表達[4]。黃芩甲苷為中藥黃芩中提取的有效成分，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用[5]。本次研究通過分析黃芩甲苷對糖尿病小鼠腎損傷以及小鼠腎小球系膜細胞的影響，探究Nrf2/Keap1信號通路在黃芩甲苷治療DN腎損傷中的作用。

1 材料

1.1 實驗動物與細胞60只SPF級雌性C57BL/6小鼠，購買于南京軍科生物工程有限公司，8～10周齡，體質量25～30 g，飼養在室溫23 ℃、12 h/12 h光暗周期條件下，自由飲水采食，飼養1周后用于實驗。小鼠腎小球系膜細胞系(SV40-Mes-13)由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所提供，選擇DMEM培養基進行細胞培養，溫度37 ℃，二氧化碳體積分數5%。

1.2 藥物與試劑RPMI 1640培養基(美國Invitrogen公司，批號：20200516)；2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白分析試劑盒(福州飛凈生物科技有限公司，批號：20200317)；細胞溶解緩沖液(武漢純度生物科技有限公司，批號：20200412)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力測定試劑盒(德國Qiagen公司，批號：20190921)；小鼠單克隆Nrf2抗體、Keap1抗體、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab89443、ab89563、ab89652)；RNA提取試劑盒(廣州雙螺旋基因技術有限公司，批號：200423)；反轉錄試劑盒(上海科博瑞生物科技有限公司，批號：210214)；對照組病毒(LV-control)、過表達Keap1慢病毒(LV-Keap1)購于擎科生物科技有限公司；miR-142 mimic、miR-142 inhibitor、si-Keap1、pcDNA-Keap1及對照物pre-NC、NC、si-control、pcDNA購自吉瑪基因公司。

1.3 儀器二氧化碳培養箱(型號：Herocell 180，上海力申儀器公司)；倒置顯微鏡(型號：BX43，日本Olympus公司)；單道手動移液器(型號：Reference?2，德國艾本德公司)；電泳槽(型號：TY-80，南京普陽科學儀器研究所)；低溫離心機(型號：KL05R，湖南凱達科學儀器有限公司)；酶標儀(型號：CA-2000，寰熙醫療器械有限公司)；凝膠成像系統(型號：BioDoc-It，美國Analytik Jena US LLC公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥60只C57BL/6小鼠中隨機選擇20只，分為對照組、正常+黃芩甲苷組，每組10只，其余40只小鼠制備糖尿病模型，具體如下：小鼠禁食12 h后，以150 mg·kg-1劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，72 h后斷尾取血，檢測血糖水平，當小鼠空腹血糖>16.17 mol·L-1表示糖尿病小鼠模型誘導成功。采用高脂飼料喂養糖尿病模型小鼠30 d，當小鼠的24 h尿蛋白增加10倍以上，且空腹血糖>16.17 mol·L-1表示DN小鼠模型建立成功。將建模成功的小鼠隨機分為DN組、DN+黃芩甲苷組、DN+ LV-Keap1組、DN+LV-control組，每組10只，對照組和DN組小鼠給予生理鹽水灌胃；正常+黃芩甲苷組、DN+黃芩甲苷組小鼠灌胃給予10 g·L-1黃芩甲苷溶液，DN+ LV-Keap1組、DN+LV-control組先尾靜脈注射0.5 mL LV-Keap1與LV-control，再給予10 g·L-1黃芩甲苷溶液灌胃，給藥體積為10 mL·kg-1，每天2次，持續干預10周。

2.2 細胞分組及處理取凍存細胞，解凍后將其接種于含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1% 雙抗的DMEM 培養基中，37 ℃、5%CO2條件下培養。取傳代培養后細胞經含25 mmol·L-1葡萄糖的高糖培養基培養后，分為10組，分別為①葡萄糖+NC組(細胞高糖培養后轉染NC)；②葡萄糖+miR-142 inhibitor組(細胞高糖培養后轉染miR-142 inhibitor以抑制miR-142表達)；③葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-control組(細胞高糖培養后進行miR-142 inhibitor和si-control共轉染)；④葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1組[細胞高糖培養后進行miR-142 inhibitor和si-Keap1(抑制Keap1表達)共轉染]；⑤葡萄糖組(細胞僅進行高糖培養)；⑥葡萄糖+黃芩甲苷組(細胞進行高糖培養后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預)；⑦葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組(細胞進行高糖培養后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并轉染pre-NC)；⑧葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic組(細胞進行高糖培養后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并轉染miR-142 mimic使miR-142過表達)；⑨葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA組(細胞進行高糖培養后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并共轉染miR-142 mimic和pcDNA)；⑩葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1組[細胞進行高糖培養后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并共轉染miR-142 mimic和pcDNA-Keap1(過表達Keap1)]。

2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測實驗結束后，取細胞培養上清液，采用SOD檢測試劑盒檢測細胞培養上清液中SOD的活性，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

2.4 Western Blot檢測小鼠腎組織及細胞中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平取處理后的細胞及腎組織，腎組織研磨后加裂解液，細胞直接加裂解液，12 000 r·min-1離心5 min，分離上清用于蛋白測定，經蛋白定量、電泳、轉膜后進行免疫反應，依次加入一抗、二抗，反應結束后進行顯色曝光，對目的條帶的灰度值進行分析，并根據測定結果計算目的蛋白Nrf2、Keap1、HO-1的相對表達量，內參選擇β-actin。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡根據凋亡檢測試劑盒說明進行細胞凋亡檢測，取對數生長期細胞，1 000 r·min-1離心5 min，獲得目的細胞，PBS沖洗后再次離心，PBS重懸，乙醇固定，400目篩網過濾1次，1 000 r·min-1離心5 min，加1.0 mL PI染液，4 ℃ 避光30 min，加AnnexinV-FITC避光染色5 min，采用Facsverse流式細胞儀進行上機檢測，每組設置復孔3個，通過熒光激活細胞分選儀檢測細胞凋亡水平。

2.6 RT-qPCR檢測miR-142mRNA的表達取小鼠腎組織滅菌后進行組織研磨，加入裂解液處理，12 000 r·min-1離心5 min，取上清。使用RNA提取試劑盒進行總RNA提取，操作過程嚴格按照RNA提取試劑盒說明進行操作，隨后使用反轉錄試劑盒進行反轉錄，根據本次實驗所需基因序列測定結果，選擇保守序列區作為擴增區域，利用Primer5.0引物設計軟件和BLAST軟件程序設計出特異性擴增引物，獲得cDNA。PCR擴增反應條件，95 ℃反應15 min，95 ℃反應10 s，60 ℃反應30 s，進行40個循環，繪制標準曲線，定量分析miR-142mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 黃芩甲苷對DN小鼠腎組織中miR-142mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表達水平的影響與對照組比較，DN組miR-142mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，Keap1、Nrf2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與DN組比較，DN+黃芩甲苷組miR-142mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，Keap1、Nrf2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：A：miR-142 mRNA表達水平比較；B：Keap1、Nrf2蛋白表達水平比較；C：Keap1、Nrf2蛋白表達條帶圖；與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05圖1 黃芩甲苷對DN小鼠腎組織中miR-142 mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表達水平的影響

3.2 黃芩甲苷對過表達Keap1的DN小鼠腎組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響與DN+LV-control組比較，DN+LV-Keap1組小鼠腎組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A:Keap1、Nrf2、HO-1蛋白條帶圖；B：Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較；與DN+LV-control組比較，aP<0.05圖2 黃芩甲苷對過表達Keap1的DN小鼠腎組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響

3.3 抑制miR-142表達對腎小球系膜細胞的影響與葡萄糖+NC組比較，葡萄糖+miR-142 inhibitor組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達水平及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；與葡萄糖+miR-142 inhibitor組比較，葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達水平及SOD水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡水平顯著升高(P<0.05)。見圖3。

注：與葡萄糖+NC組比較，*P<0.05；與葡糖糖+miR-142 inhibitor組比較，#P<0.05；A：腎小球系膜細胞Keap1、Nrf2蛋白表達條帶圖；B：Keap1、Nrf2蛋白表達水平比較；C：化學比色法檢測SOD水平；D：流式細胞儀檢測細胞凋亡圖3 抑制miR-142表達對腎小球系膜細胞的影響

3.4 黃芩甲苷對腎小球系膜細胞的影響與葡萄糖組比較，葡萄糖+黃芩甲苷組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組比較，葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，與葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA組比較，葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：與葡萄糖組比較，*P<0.05；與葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組比較，#P<0.05；與葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA比較，&P<0.05；A：Nrf2、Keap1蛋白條帶圖；B：Nrf2、Keap1蛋白相對表達量；C：SOD水平比較；D：細胞凋亡率比較圖4 黃芩甲苷對腎小球系膜細胞的影響結果

4 討論

DN屬于糖尿病常見并發癥，是造成糖尿病患者死亡的主要并發癥之一[6]。本次研究通過構建DN模型發現DN小鼠存在miR-142表達升高情況。糖尿病屬“消渴”范疇，氣陰兩虛為該病主要病機，氣能行血，血無氣衰，則血行瘀滯，瘀血不僅作為病理產物，更是致病因素，進而引發一系列血管并發癥，其中就包含糖尿病腎病[7]。腎小球具有豐富的毛細血管，回旋迂曲且細長，極易發生損傷，與中醫所述脈絡特征類似。已有大量研究證實，中醫血瘀與炎癥反應、氧化應激反應之間存在密切聯系，而Nrf2/Keap1信號通路參與機體炎癥反應及氧化過程，因此選取該信號通路作為本次的研究方向，探究其干預機制[8]。

黃芩是臨床上常用的清熱燥濕藥，《神農本草經》記載：“黃芩，味苦平，主諸熱黃疽，腸澼，泄利，逐水，下血閉，惡創恒蝕，火瘍。”黃芩以根入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等功效。現代研究表明，黃芩具有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病及抗病毒等作用[9]。黃芩甲苷是中草藥黃芩的主要有效成分，可有效上調Keap1蛋白表達，從而對H2O2誘導的細胞凋亡產生抑制作用[10]。有學者展開動物研究發現，黃芩甲苷可抑制DN動物腎組織細胞凋亡，降低腎臟損傷，使腎臟抗氧化能力增強，抑制DN進展[11]，且黃芩甲苷可激活Nrf2，對多種疾病導致的組織損傷起到抑制作用[12-15]。本次研究基于Nrf2/Keap1通路探討黃芩甲苷對于DN小鼠的影響。

在細胞增殖、分化、生長以及凋亡過程中均有成熟miRNA參與，miR-142是近幾年醫學研究的熱門，多數學者認為其參與腫瘤發生及發展，是導致病變組織纖維化的重要因素[16-17]。研究指出，miR-142與腎纖維化發生發展存在密切聯系[18]。本次研究通過分析腎組織中miR-142表達水平進一步證實DN小鼠腎組織中存在miR-142表達水平升高的情況，但經黃芩甲苷干預后其表達降低。研究指出，激活Nrf2可緩解DN造成的腎臟損傷[19-20]，因此，可通過靶向激活Nrf2的方式緩解糖尿病引起的腎臟損傷[21]。本次研究對小鼠進行黃芩甲苷干預后顯示，黃芩甲苷可有效上調小鼠腎組織中Nrf2表達。Keap1可在生理狀態下與Nrf2發生耦聯，廣泛存在于機體各種細胞中[22-23]。研究證實，Keap1可通過促進高糖環境下腎臟細胞能量穩態重建的方式干預DN造成的腎組織損傷，從而抑制腎臟損傷，降低細胞凋亡率[24]。本次研究對小鼠腎臟組織中Keap1表達情況進行分析顯示，黃芩甲苷可有效升高腎組織中Keap1的表達水平，并且注射過表達Keap1慢病毒后，HO-1表達升高，進一步證實Keap1在DN發生發展中的腎保護作用，可能是黃芩甲苷對DN小鼠Nrf2/Keap1通路產生影響，從而抑制miR-142表達，該結果與已有報道一致[25-26]。

本次研究選取高糖培養的腎小球系膜細胞系進行體外研究，結果顯示，腎小球系膜細胞在轉染 miR-142inhibitor后，Nrf2、Keap1蛋白表達升高，在對SOD及細胞凋亡情況進行分析時發現，細胞凋亡率明顯降低，而SOD水平升高，而共轉染si-Keap1細胞出現miR-142inhibitor轉染作用逆轉情況，Nrf2、Keap1蛋白表達降低，細胞凋亡升高，SOD降低，提示miR-142inhibitor轉染所產生的保護作用可被 si-Keap1逆轉。SOD是評估機體氧化反應情況的重要指標，被稱為氧自由基殺手，可有效清除機體氧自由基[27]，而氧自由基是造成組織損傷的關鍵因素[16]。本次研究結果顯示，通過提高SOD水平降低氧化應激損傷的發生，激活Nrf2/Keap1信號通路抑制miR-142表達，進而對腎臟起到保護效果[28]。通過動物研究發現，黃芩甲苷可降低DN小鼠腎臟組織中miR-142表達，因此本次研究在細胞體外研究時同樣進行黃芩甲苷干預，結果顯示，黃芩甲苷可逆轉高糖培養的腎小球系膜細胞損傷，升高Nrf2、Keap1蛋白表達，降低細胞凋亡率，增加SOD水平。進一步分析發現，過表達miR-142可逆轉黃芩甲苷所產生的細胞保護作用，共表達Keap1、miR-142時，過表達Keap1使miR-142 mimic對細胞產生的影響再次被逆轉。通過以上研究數據可以看出，黃芩甲苷對于高血糖導致的腎臟損傷可以起到保護作用，而且該作用是通過抑制miR-142表達并激活Nrf2/Keap1信號通路完成的。

綜上所述，糖尿病腎病存在miR-142過表達情況，從而抑制Nrf2/Keap1通路激活，黃芩甲苷可逆轉miR-142對Nrf2/Keap1信號通路的抑制作用，提高Keap1、Nrf2表達，進而達到改善糖尿病腎病的目的。