基于IL-4/STAT6通路研究吳茱萸次堿對特應性皮炎模型小鼠的改善作用*

頓耿，祁相煥，吳德福，臧馥蘭，王哲新

開封市人民醫院，河南 開封 475000

特應性皮炎又稱遺傳過敏性皮炎，是一種慢性非特異性皮膚炎癥，好發于兒童，主要表現為瘙癢、皮膚干燥和濕疹，嚴重影響患者的生活質量[1]。吳茱萸次堿是一種吲哚喹唑啉類生物堿，提取自傳統中藥吳茱萸。研究發現，吳茱萸次堿具有廣泛的藥理學活性，可通過調節免疫失衡、降低氧化應激反應保護局灶性腦缺血腦組織損傷[2]，口服吳茱萸次堿可激活抗氧化酶保護乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷，改善肝功能[3]，吳茱萸堿衍生物還可通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(nucleotides bind to oligomeric domain-like receptor 3，NLRP3)炎癥體相關炎癥因子調節膽固醇轉運，從而減輕動脈粥樣硬化[4]。輔助性T淋巴細胞1(T-helper 1，Th1)/Th2細胞亞群功能失衡是特應性皮炎發病的主要原因之一，白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是誘導Th2細胞分化的關鍵調節因子，也是Th2細胞的特征性細胞因子，而信號轉導及轉錄激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)是Th2細胞的特異性轉錄因子[5]，研究發現，白頭翁皂苷B4可通過抑制IL-4/STAT6信號通路降低炎癥反應，改善慢性阻塞性肺疾病損傷[6]。既往研究顯示，吳茱萸次堿可改善炎癥性皮膚病(銀屑病)的癥狀，調節免疫細胞，減輕炎癥反應[7]。本研究通過建立特應性皮炎小鼠模型，探討吳茱萸次堿對炎癥性皮膚病的治療作用機制。

1 材料

1.1 動物50只4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量20～25 g，購自北京北科華夏生物醫藥科技有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2017-0044，飼養環境：室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，自由飲食飲水，晝夜交替12 h。該實驗經開封市人民醫院動物倫理委員會批準，倫理審批號：KFSRMYY2019050026。

1.2 藥物與試劑吳茱萸次堿(武漢科斯坦生物科技有限公司，純度≥98%，批號：84-26-4)；潑尼松龍(北京康瑞納生物科技有限公司，批號：B6374)。HE試劑盒、丙酮、橄欖油(上海碧云天生物科技有限公司，批號：C0105、ST1663、KNK437)；2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB，美國Sigma公司，批號：265179)；細胞因子干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、IL-4、IL-5、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：KHC4021、A42893、BMS610、EMIGHE)；兔抗鼠STAT6抗體、嗜酸粒細胞趨化因子(eotaxin)抗體、細胞因子信號抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)抗體、GAPDH抗體(美國Abcam公司，貨號：ab32108、ab133604、ab280884、ab8245)。

1.3 儀器1658033型電泳儀(美國BIO-RAD公司)；A51119500C型酶標儀、ST16R型低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；XPR226CDR/AC型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；EG1150型包埋機、RM2255型切片機、DM2700P型顯微鏡(德國徠卡公司)；VE-186型轉移電泳槽、Tannon-2500型凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備和給藥50只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、吳茱萸次堿低劑量組和吳茱萸次堿高劑量組，每組10只，除正常組外，其余組小鼠建立特應性皮炎模型[8]，具體操作如下：在小鼠耳部無損傷皮膚3 mm×3 mm范圍內剃毛，丙酮和橄欖油以體積比31配制，添加DNFB制成濃度為1%的混懸液，第1天和第8天在每只小鼠耳部裸露皮膚上涂抹100 μL 1% DNFB混懸液，第15天和第16天相同部位剃毛，涂抹50 μL 1% DNFB混懸液，以出現抓痕、紅斑出血、結痂等表現視為造模成功，正常組小鼠相同部位剃去毛發，并于相同時間點涂抹丙酮和橄欖油混懸液。造模成功4 h后，陽性對照組小鼠灌胃給予10 mg·kg-1潑尼松龍溶液，吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠灌胃給予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1吳茱萸次堿溶液，正常組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續14 d。

2.2 耳部炎癥評分測定末次給藥結束后，評估耳部皮損處炎癥嚴重程度，并進行評分，0分為無皮損；1分為無皮損但可察覺紅斑和丘疹或浸潤；2分為輕度紅斑和丘疹或浸潤；3分為中度紅斑和丘疹或浸潤；4分為重度紅斑和丘疹或浸潤；5分為非常嚴重的紅斑和丘疹或浸潤，同時伴有滲出和結痂。手術剪獲取各組小鼠右耳，并用游標卡尺測量皮損部位厚度。

2.3 ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量小鼠麻醉后，打開胸腔，收集主動脈血，室溫靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，收集上清為待測樣品，根據ELISA試劑盒說明書，梯度稀釋標準品，設置空白孔、對照孔和待測樣品孔。加入待測樣品后，輕輕搖晃混勻，置于37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，加入抗體稀釋液后，37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，加入親和素過氧化物酶復合物后，37 ℃避光孵育30 min，洗滌液清洗5次，甩干，加入顯色液，顯色30 min，加入終止液終止反應，置于酶標儀上，測定波長450 nm處的吸光度(absorbance，A)值，根據標準品，建立標準曲線，測定待測樣品濃度。

2.4 耳部組織HE染色剪取部分耳組織，常規脫水、包埋、制成厚度為4 μm的石蠟切片，滴加蘇木素染液于組織切片上染色5 min，酸性乙醇分化，雙蒸水沖洗，滴加伊紅染液于組織切片上染色3 min，雙蒸水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 Western Blot檢測耳組織中相關蛋白表達水平取部分耳組織，液氮中研磨，加入裂解液裂解 30 min，12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑 10 cm)，收集上層蛋白樣品，BCA試劑盒測定蛋白濃度，裂解液調整蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性穩定。設置電泳儀恒壓80 V電泳30 min后120 V電泳1.5 h，電泳結束后，設定電泳儀參數恒流0.3 A濕轉2 h，TBST洗膜3次，胎牛血清室溫封閉1 h，加入STAT6、SOCS1、eotaxin和GAPDH一抗(稀釋比例為11 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

3 結果

3.1 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠皮炎評分及右耳厚度的影響與正常組比較，模型組小鼠耳部出現充血水腫、糜爛、干燥脫屑、結痂等炎性癥狀，皮炎評分及右耳厚度顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠耳部炎性癥狀減輕，皮炎評分及右耳厚度明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠皮炎評分及右耳厚度顯著升高(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組小鼠皮炎評分及右耳厚度顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠皮炎評分及右耳厚度的影響

3.2 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影響與正常組比較，模型組IL-4、IL-5和IgE含量顯著升高(P<0.05)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組IL-4、IL-5和IgE含量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組IL-4、IL-5和IgE含量顯著升高(P<0.05)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組IL-4、IL-5和IgE含量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影響

3.3 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠耳部組織結構的影響正常組小鼠耳部組織皮膚結構正常完整，無水腫和炎性細胞浸潤；模型組小鼠皮膚結構缺失，明顯水腫，可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，各給藥組小鼠耳部組織病理損傷得到顯著改善，其中陽性對照組和吳茱萸次堿高劑量組小鼠皮膚結構較完整，細胞輕度水腫，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性對照組；D：吳茱萸次堿低劑量組；E：吳茱萸次堿高劑量組圖1 小鼠耳部組織HE染色(×200)

3.4 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠耳部組織中 IL-4/STAT6信號通路相關蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組 IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 吳茱萸次堿對特應性皮炎小鼠耳部組織中IL-4/STAT6信號通路相關蛋白表達水平的影響

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性對照組；D：吳茱萸次堿低劑量組；E：吳茱萸次堿高劑量組圖2 Western Blot檢測特應性皮炎小鼠耳部組織IL-4/STAT6信號通路相關蛋白表達水平

4 討論

特應性皮炎是一種由皮膚功能障礙及免疫反應引起的慢性皮膚病，其致病因素與遺傳、感染、免疫失衡等有關，受干擾部分的皮膚組織對外部抗原或過敏原滲透性增強，導致角質層細胞先天免疫因子釋放增加及Th2型T細胞浸潤增加，Th2細胞分泌多種炎性因子，包括IL-4、IL-5和IL-13，多種炎性細胞的浸潤導致特應性皮炎的發生[9]。目前，對于特應性皮炎的治療常采用局部使用類固醇或抗菌藥物，但常規治療手段存在不良反應，因此尋找有效的治療藥物和靶點是臨床研究的熱點。

中醫認為特應性皮炎屬于“乳癬”“奶癬”“胎斂瘡”等病證范疇，中醫學者對其具體病因有豐富的論述，多數學者認為該病因為先天稟賦不足、脾失健運、生濕化熱，復感風濕邪熱，蘊結肌膚，內外合邪而致，根據病因不同可分為胎熱型、脾虛型和血造型。吳茱萸屬蕓香科植物，所含化學成分包括生物堿、苦味素和揮發油等，始載于《神農本草經》，其主要成分吳茱萸次堿具有多種藥理學活性，可保護阿霉素造成的H9C2心肌細胞損傷，增強細胞活力，抑制細胞凋亡[10]，還可通過調節免疫平衡，在前列腺癌小鼠中發揮抗癌作用[11]，改善高蔗糖誘導的阿爾茨海默病小鼠認知功能障礙[12]，抑制Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)炎性信號通路保護大鼠心肌缺血再灌注損傷[13]。此外，吳茱萸次堿在炎癥性疾病中具有顯著療效，可降低葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子，減輕結腸組織病理損傷[14]，通過調節降鈣素基因相關肽減輕急性胰腺炎小鼠病理損傷[15]。本研究通過建立特應性皮炎小鼠模型，探討吳茱萸次堿對該疾病的作用，結果顯示，特應性皮炎小鼠耳部皮損組織結構缺失，明顯水腫，可見大量炎性細胞浸潤，皮炎評分升高，右耳明顯增厚，吳茱萸次堿治療后小鼠耳部皮膚組織結構較完整，細胞輕度水腫，少量炎性細胞浸潤，皮炎評分降低，右耳厚度減小。免疫細胞Th1和Th2之間的平衡對于保持機體免疫功能穩定尤為重要，Th1/Th2失衡可導致多種疾病，如過敏性疾病和免疫失調[16-18]。已有研究發現，免疫細胞失衡與特應性皮炎密切相關[19]。IFN-γ是Th1細胞群分泌的主要細胞因子之一，IFN-γ可抑制IgE的合成，IgE水平與特應性皮炎小鼠皮損嚴重程度有關[20]。IL-4和IL-5是Th2細胞群分泌的主要細胞因子，二者可促進B淋巴細胞合成IgE[21]。此外，IFN-γ抑制Th2細胞群分泌IL-4和IL-5，抑制免疫細胞向Th2分化，使免疫細胞向Th1分化，阻斷IgE合成，降低嗜酸性粒細胞表達和浸潤[22]。本研究發現，特應性皮炎小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE含量升高，而IFN-γ含量降低，吳茱萸次堿治療后IL-4、IL-5和IgE含量降低，而IFN-γ含量升高，提示吳茱萸次堿可改善特應性皮炎小鼠病理癥狀，調節免疫平衡。

IL-4是誘導Th2細胞分化的關鍵調節因子，也是Th2細胞特征性細胞因子。STAT6是具有信號傳遞及轉錄因子雙重功效的DNA結合蛋白，其核轉位及轉錄活性由IL-4和IL-3調節，IL-4可使STAT6單體募集到IL-4受體的α鏈上，發生磷酸化，磷酸化后的STAT6二聚化轉位入核，并結合于特定的DNA元件上，激活IL-4相關基因的轉錄及蛋白質合成[23]。SOCS1的表達活性由STAT6基因在轉錄水平上調節，參與下調IL-4受體活性，通過STATs通路參與Th細胞極化，在穩定Th1和Th2表型中具有重要作用[24]。eotaxin屬于CC趨化因子成員，其受體是CCR3，主要作用于單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等。研究發現，在A549肺癌細胞中，IL-4激活STAT6和eotaxin，促進癌細胞的炎癥反應[25]。本研究檢測特應性皮炎小鼠耳部組織中各蛋白變化發現，模型組小鼠耳組織中STAT6和eotaxin蛋白相對表達量升高，SOCS1蛋白相對表達量降低，而吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠耳組織中STAT6和eotaxin蛋白相對表達量降低，SOCS1蛋白相對表達量升高，提示，吳茱萸次堿參與調節IL-4/STAT6/SOCS1/eotaxin信號通路。

綜上所述，吳茱萸次堿可改善特應性皮炎小鼠癥狀，降低炎癥反應，其機制可能與調控IL-4/STAT6信號通路有關，為臨床治療特應性皮炎提供理論依據。