2型糖尿病模型大鼠心肌微血管病變的觀察*

張夢笛，崔鑫鈺，袁悅瑩，張雨婷，于雪，吳晏

北京中醫藥大學，北京 100029

糖尿病是全球流行的慢性終身代謝性疾病，近年來，我國糖尿病患者數量急劇增加，帶來沉重的經濟負擔。糖尿病患者發生心血管疾病的比例和嚴重程度都高于非糖尿病患者，心血管并發癥是糖尿病患者死亡的主要病因[1-2]。微血管病變是糖尿病心血管并發癥的一個重要類別，血管生成因子表達減少和血管生成受損是其主要表現。在糖尿病進程中，心臟微血管病變通常先于大血管，這使得心臟更易受到缺血性損傷[3-4]。高血糖可破壞微血管內皮細胞完整性，導致毛細血管和小動脈嚴重受損，同時阻礙新生血管生成，微血管密度降低[5]。心肌微血管數量的逐漸減少導致心肌灌注降低，最終引發心臟功能障礙和進行性心力衰竭。同時，血管生成障礙又加重了糖尿病的臨床表現，如心肌缺血、壞死等。因此，保護心臟微血管對于延緩或減輕糖尿病心血管并發癥至關重要[6]。促進心臟血管生成和改善微循環功能已成為改善糖尿病引起的不良心血管事件的潛在靶點[7-8]。

糖尿病大鼠模型是進行藥理研究的常用動物模型。目前，對于糖尿病引起的心肌微血管病變的研究較少，并且既往實驗多采用1型糖尿病模型進行研究。然而，2型糖尿病占糖尿病發病總數的90%～95%[9]，是最為普遍的糖尿病類型。雖然1型糖尿病和2型糖尿病均可引起心血管并發癥，但是二者的疾病特征與機制并不完全相同。采用更為貼合人類2型糖尿病病變特點的動物模型探討其糖尿病心肌微血管病變的特點與機制是臨床前藥物評價以及藥理機制研究的工作基礎，具有重要意義。本研究采用經典的高脂飼料喂養合并單次腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法復制2型糖尿病大鼠模型，于模型成功建立12周后觀察心功能與毛細血管密度的改變，并對血管生成相關機制進行了初步探討，旨在探尋具備2型糖尿病心肌微血管病變的實用動物模型，為相關藥物研究提供工作基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 動物雄性SPF級SD大鼠18只，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養在北京中醫藥大學SPF級動物房，使用許可證號：SYXK (京) 2020-0033，溫度(23±2) ℃，濕度(55±5)%，12 h/12 h明暗交替，自由飲食、水。動物實驗經北京中醫藥大學倫理委員會審批通過，倫理審批號：BUCM-4-2020091503-3148。實驗過程均嚴格遵循3R原則，給予人道關懷。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，德國sigma公司，貨號：S0130)；口服葡萄糖粉劑[廣西梧州制藥(集團)股份有限公司，國藥準字：H45021416]；檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，0.1 mmol·L-1，pH4.5，貨號：C1013)；Masson染色試劑盒、蘇木素伊紅染液、血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31)兔多克隆抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1006、G1005、GB11063-2)；β-肌動蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)兔多克隆抗體、酪氨酸激酶受體-2(tyrosie kinase with Ig and EGF homology domain，Tie-2)兔多克隆抗體(美國Proteintech公司，貨號：20536-1-AP、23302-1-AP、19157-1-AP)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-7269)；磷酸化血管內皮生長因子受體2(phospho-VEGF receptor 2，p-VEGFR2)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinins，WGA)兔多克隆抗體(英國abcam公司，貨號：ab5473、L5142)；Wes全自動蛋白質定量試劑盒(美國Protein Simple公司，貨號：SM-W001)；高脂飼料[膽固醇1%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽酸鈉0.5%、基礎飼料 83.5%，斯貝福(北京)生物技術有限公司]。

1.3 儀器Onetouch Ultraeasy型血糖儀、Onetouch Ultra型試紙(美國強生公司)；JT-12S型脫水機、JB-L7型包埋機、JJQ-P3116型病理切片機(武漢俊杰電子有限公司)；ICC50HD型光學顯微鏡(德國Leica公司)；Pannoramic SCAN型數字切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；Wes型全自動蛋白質印跡定量分析系統及配套試劑(美國ProteinSimple公司)；Vevo2100型小動物超聲影像系統 (加拿大Visual Sonics公司)。

2 方法

2.1 動物分組與造模18只大鼠適應性飼養1周后，根據體質量均衡原則分為正常組(8只)和模型組(10只)。正常組予以普通飼料喂養，模型組予以高脂飼料喂養。4周后，模型組大鼠禁食12 h，腹腔注射35 mg·kg-1STZ建立2型糖尿病模型，模型建立7 d后檢測空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol·L-1為造模成功[10]；正常組腹腔注射相應劑量的檸檬酸鈉緩沖液。模型成功后，正常組給予普通飼料，模型組給予高脂飼料繼續喂養12周。

2.2 口服糖耐量實驗模型建立12周后，測量大鼠的體質量(body weight，BW)，并進行口服糖耐量實驗，具體如下：兩組動物禁食不禁水12 h，尾尖部靜脈取血測定血糖后按2 g·kg-1劑量灌胃給予葡萄糖溶液，并于灌胃后30 min、60 min、120 min尾尖采血檢測血糖變化，用Graphpad prism軟件計算曲線下面積(area under curve，AUC)。

2.3 心臟功能檢測將大鼠麻醉后置于平臺上，采用Visual Sonics Vevo 2100小動物超聲影像系統經胸骨旁短軸切面進行二維M型超聲心動圖檢查，使用Vevo 2100分析軟件進行數據分析，計算左心室射血分數(ejection fractions，EF)和短軸縮短率(short-axis fractional shortening，FS)。

2.4 HE染色與Masson染色超聲檢測后，經大鼠腹主動脈取血后，處死動物迅速分離心臟，隨后放入預冷的生理鹽水中，反復沖洗至心臟中無血液，漂凈并擦干水分后，迅速取大鼠左心室心肌組織，部分放入4%多聚甲醛進行固定，部分立即放入液氮中保存備用。取固定好的心臟組織，常規脫水、包埋、切片，并進行HE染色與Masson染色，并于400倍光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織結構及膠原纖維含量變化，每個樣品選取5個視野，并采集圖像，使用Image J軟件分析膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)。

2.5 免疫組化染色法檢測心肌組織CD31的表達石蠟切片經二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，置于檸檬酸抗原修復液中修復抗原，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min阻斷內源性過氧化物酶，3%BSA室溫封閉30 min，甩除后加50 μL CD31一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃孵育過夜后，滴加HRP標記的二抗(稀釋比例為1200)覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，沖洗切片以終止顯色。蘇木素復染，梯度酒精、二甲苯及中性樹膠脫水、透明、封片。用數字切片掃描儀掃描染色切片，CD31陽性細胞呈棕黃色，每張切片隨機選取3個視野在400倍下進行毛細血管計數，除以視野面積(約0.18 mm2)即為毛細血管密度。

2.6 WGA染色檢測心肌細胞肥大情況石蠟切片經二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，置于EDTA抗原修復液中抗原修復，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，切片甩干后滴加WGA染液，避光37 ℃恒溫孵育30 min，DAPI復染細胞核，PBS洗滌后滴加自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。采用數字切片掃描儀掃描染色切片，并使用3DHISTECH配套分析平臺CaseViewer 2.4.0對心肌細胞面積進行測量。綠色表示心肌細胞邊界，400倍下每張切片隨機選取3個視野，每視野取10個細胞，量化平均心肌細胞面積(μm2)，以確定是否存在心肌細胞肥大改變。

2.7 Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統檢測心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2的表達采用Wes全自動蛋白質定量試劑盒使用Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統[11]進行蛋白表達水平檢測，每個樣品上樣量為3 μL(5×Master Mix 0.6 μL，樣品原液與0.1×Sample Buffer共 2.4 μL，以95 ℃、10 min條件變性)。一抗使用試劑盒自帶的Antibody diluent 2進行稀釋(β-actin、Ang-1、Tie-2稀釋比例為1100；VEGF、p-VEGFR2稀釋比例為150)。樣品及一抗制備好后，按照封閉液、一抗、二抗、樣品、發光液、清洗液的順序逐孔加入12～230 kDa Wes測定板，機器自檢無異常后，放入測定板及毛細管，開始檢測后，機器通過毛細管抽取400 nL樣品，按分子量大小對蛋白質進行電泳分離，然后通過使用HRP偶聯的二抗對心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2進行基于HRP的檢測。以β-actin作為內參蛋白，用目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示該目的蛋白的表達量。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀況比較模型建立12周后，與正常組相比，模型組大鼠BW明顯降低(P<0.01)。注射STZ 7 d后，模型組共有8只大鼠空腹血糖值符合模型成功判定標準，且與正常組相比，模型成功大鼠的血糖值明顯升高(P<0.01)，并出現明顯的多飲、多食、多尿的癥狀。模型建立12周后，與正常組相比，模型組大鼠的空腹血糖明顯降低(P<0.01)?？诜悄土繉嶒灠l現，兩組大鼠的血糖值均先升高后降低，正常組大鼠的血糖在30 min時達到峰值，而模型組大鼠的血糖在60 min時才達峰值；與正常組相比，模型組大鼠AUC顯著升高(P<0.01)。綜合大鼠體質量、空腹血糖和糖耐量實驗結果可知，2型糖尿病模型建立成功且保持穩定。見表1，圖1。

表1 各組大鼠空腹血糖及體質量比較

注：n=6；A:血糖變化；B:AUC變化；與正常組相比，**P<0.01圖1 各組大鼠口服糖耐量比較

3.2 各組大鼠心功能比較經超聲心動圖檢測大鼠心功能發現，與正常組相比，模型組大鼠的左心室射血分數和左心室短軸縮短率均明顯降低(P<0.01)，提示模型大鼠已出現明顯左心室收縮功能障礙。見圖2。

注：n=6；A:EF比較；B:FS比較；與正常組相比，**P<0.01圖2 各組大鼠心功能指標比較

3.3 各組大鼠心肌纖維化和心肌細胞肥大比較HE染色顯示：正常組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞形態正常、邊界清晰；而模型組大鼠心肌組織染色不均勻，肌束排列紊亂，出現大量結締組織增生。Masson染色評估大鼠心肌纖維化情況，圖中呈藍色的為膠原纖維，呈紅色的為肌纖維和紅細胞，結果顯示：正常組大鼠心肌組織分布均勻，結構清晰，細胞排列整齊，心肌細胞間質和周圍血管無明顯藍色膠原纖維；而模型組的心肌組織尤其是微血管周圍有大量膠原纖維沉積，心肌組織結構破壞。與正常組相比，模型組大鼠CVF明顯升高(P<0.01)。免疫熒光染色顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌細胞面積明顯升高(P<0.01)。見圖3-圖5。

圖3 各組大鼠心肌組織HE、Masson染色圖(×400，n=6)

注：n=6，與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖4 各組大鼠膠原容積分數比較

注：n=6；A:WGA染色圖(×400)；B:心肌細胞面積比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖5 各組大鼠心肌細胞WGA染色圖及面積分析

3.4 各組大鼠心肌組織CD31的表達水平比較作為內皮細胞的標志物，CD31陽性代表毛細血管密度的變化，因此采用CD31染色檢測大鼠心肌毛細血管密度。結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中CD31陽性細胞密度顯著降低(P<0.01)。見圖6。

注：n=6；A:CD31染色示意圖(×400)；B:毛細血管密度比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖6 各組大鼠心肌組織CD31表達水平比較

3.5 各組大鼠心肌組織VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2蛋白表達水平比較Wes全自動蛋白質印跡定量分析結果表明，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。見圖7。

注：n=6；A:各蛋白條帶圖；B:各蛋白表達水平比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖7 Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統檢測心肌組織中相關蛋白表達

4 討論

本研究采用高脂飼料喂養合并小劑量注射STZ的方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ后，模型組大鼠體質量明顯降低，空腹血糖明顯升高，并出現明顯的多飲、多食、多尿癥狀，提示2型糖尿病模型復制成功。在糖尿病模型建立12周后，心臟超聲結果顯示，左心室射血分數和短軸縮短率比值明顯降低，心功能下降；病理結果顯示有心肌細胞肥大與心肌纖維化改變，由此可明確，本研究建立的2型糖尿病模型大鼠存在心功能受損。進一步研究發現，模型大鼠心肌毛細血管密度顯著降低，通過對血管生成相關蛋白進行檢測可知，與VEGF和Ang-1及其受體表達降低有關。綜上所述，糖尿病心功能障礙、心臟重構與微血管病變有關，包括血管生成因子表達減少、微血管稀疏等。

糖尿病患者血管內皮生長因子發揮生理作用與維持正常的心肌毛細血管密度和左心室功能有關[12]。VEGF作為重要的血管內皮生成因子，在生理或病理情況下對血管生成都具有中心調控作用[13]，可刺激內皮細胞生長，促進血管新生[14]。VEGFR2是VEGF促進內皮細胞增殖和遷移的主要特異性受體及關鍵信號傳導因子[15]。VEGFR2與VEGF結合后形成二聚體，并發生磷酸化[16]，p-VEGFR2繼而調控下游信號通路，通過增殖、遷移和抗凋亡等途徑維持內皮細胞生存，促進新生血管形成[17-18]。既往研究顯示，糖尿病可引起VEGF/p-VEGFR2水平明顯下調[19-21]，導致血管生成受損，心肌毛細血管密度降低[14]；VEGF表達水平和毛細血管密度的顯著降低可導致DCM患者左心室功能障礙[22]。

VEGF/p-VEGFR2信號系統在血管新生過程中起主導作用，而Ang-1/Tie-2信號通路在血管成熟與穩定中起關鍵作用[23]。糖尿病血管生成異常與Ang-1/Tie-2信號通路傳導受損密切相關[24-25]。Tie-2是內皮特異性受體酪氨酸激酶，Ang-1是其關鍵配體，Tie-2與Ang-1結合后發生磷酸化，在血管發育成熟中發揮重要作用。Ang-1 通過募集平滑肌細胞到新生血管中，使其形成肌性小動脈和靜脈，促進新生血管在初始階段進一步發育成熟[26]，達到改善心肌血流、修復心肌的目的[27-30]，激活Ang-1/ Tie-2信號通路可顯著提高毛細血管密度[25，31]。

在糖尿病進程中，心臟微血管損害的發生早于大血管[32]，故糖尿病患者心臟中血管內皮生長因子表達降低、微血管生成減少、血管密度降低[33-35]是引起心血管并發癥、心臟功能障礙和進行性心力衰竭的重要因素[12，36]，并最終導致心血管并發癥發病率和死亡率增加[4]。促血管生成因子及其受體的異常表達及信號傳導障礙是糖尿病誘發血管生成障礙的主要原因。本研究中Wes全自動蛋白定量檢測結果表明，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2的蛋白表達均明顯降低，提示心肌血管生成相關信號通路VEGF/VEGFR2與Ang-1/Tie-2受損，可能與2型糖尿病介導的心肌血管生成障礙相關。

本研究采用高脂飼料喂養合并單次腹腔注射小劑量STZ的方法復制2型糖尿病大鼠模型，結果顯示，在模型建立12周后，模型動物出現明確的心肌微血管病變與心功能損傷，是符合2型糖尿病心肌微血管病變相關藥理研究需要的理想動物模型。